翻译后修饰（Post-translational modifications,PTMs）是指蛋白在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程,通过在特定氨基酸残基上加上修饰基团来改变蛋白质的性质。蛋白质是生命活动的主要承担者,其生物活性的激活及相应功能的发挥都离不开PTMs。常见的PTMs包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、糖基化等。伴随着定量蛋白质组学技术的发展,一些新型的PTMs形式陆续被发现,如赖氨酸苯甲酰化（Lysine benzoylation,Kbz）、乳酸化（Lysine lactylation,Kla）、β-羟基丁酰化（Lysineβ-hydroxybutyrylation,Kbhb）等,但这些修饰所介导的生物功能仍有待探索。自噬激酶Unc-51样激酶1（Unc-51-like kinase 1,ULK1）通过磷酸化下游底物调控多种肿瘤过程,但已知其调控的磷酸化底物位点仍非常有限。由于鉴定蛋白质PTMs的底物谱对其功能研究至关重要,因此本文通过多种定量蛋白质组学技术对Kbhb修饰底物谱以及ULK1介导的磷酸化底物谱进行了鉴定,并利用生物信息学对数据进行分析,探索了它们的生理功能。本文的第一个研究方向是对由β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate,BHB）转化而来的Kbhb底物谱进行鉴定和分析。我们通过细胞培养条件下稳定同位素标记（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）定量蛋白质组学技术鉴定了小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中Kbhb修饰底物谱。结果表明,经BHB诱导后,MEF细胞中共有840个独特的Kbhb位点（429个蛋白）被鉴定,其中39个蛋白质上的42个Kbhb位点修饰水平相比于对照组增加了50%以上,上调的Kbhb参与氨酰-t RNA生物合成、2-氧羧酸代谢、柠檬酸循环、丙酮酸代谢等多种生物途径。与Kbhb不同,经BHB诱导后,上调与下调的赖氨酸乙酰化（Lysine acetylation,Kac）位点数基本相当,且上调的Kac蛋白主要与黏着斑、癌症中的蛋白多糖和RNA转运过程相关。这些发现拓宽了Kbhb底物谱,为Kbhb功能研究奠定了基础。本文的第二个研究方向是对ULK1介导的磷酸化底物谱进行鉴定和分析。ULK1作为自噬的起始开关,在调控肿瘤生长方面有着复杂而未知的机制。我们通过非标记（Label free）定量蛋白质组学技术,发现ULK1激酶活性被抑制后,丙酮酸脱氢酶E1α亚单位（Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha,PDHA1）、微小染色体维持缺陷蛋白3（Minichromosome maintenance deficient 3,MCM3）等多个与肿瘤密切相关蛋白的磷酸化水平显著下调,且ULK1特异调控的蛋白广泛分布于多种细胞器中,功能富集分析显示这些显著变化蛋白与DNA转录、生物合成、代谢等多种基本生物功能相关,提示其可能发挥自噬以外的功能。然后,我们利用SILAC方法鉴定了敲降ULK1细胞系中显著变化的磷酸化底物,它们参与能量代谢、细胞分裂、信号转导、免疫反应等生物过程。此外,我们利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）鉴定并验证了ULK1的互作蛋白β-微管蛋白4A（Tubulin beta-4A chain,TUBB4A）,进一步表明ULK1与肿瘤等疾病发生密切相关,可能为肿瘤治疗提供新靶点和方向。