论文部分内容阅读
背景:结肠癌是消化道最为常见的恶性肿瘤,由于其发病率高,对人类社会带来巨大的经济负担。目前手术和放化疗难以取得理想的疗效,因此寻找新的治疗方法来提高患者的生存率显得尤为迫切。近几年,一种新的治疗方式--光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)逐渐被人们接受和关注,PDT以其并发症少、创伤小、可重复应用且与其它疗法相互干扰影响小等优点成为当前最有推广前景的生物疗法。研究认为PDT诱导肿瘤细胞凋亡的机制存在细胞特异性,而p53的突变很可能是减慢PDT诱导肿瘤细胞发生凋亡速度的重要原因之一。那么PDT杀伤结肠癌细胞是否呈现p53wt依赖性?p53wt是如何协同PDT杀伤结肠癌细胞的呢?这些疑问都亟待解决。目的:研究野生型p53介导PDT杀伤结肠癌细胞的作用机制,为PDT在结肠癌的临床治疗上提供科学依据。方法:1.体外研究通过MTT实验比较p53wt和p53mut两组细胞经PDT处理后细胞活力变化;再用RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116细胞进一步验证PDT处理后细胞活力变化;动物实验选用RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116细胞分别进行裸鼠成瘤实验,待肿瘤体积长到一定大小用PDT处理,观察肿瘤体积变化并记录各组实验裸鼠的生存情况。2.在结肠癌组织样品、RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116中检测mi R-124的表达情况;并在四株细胞中验证mi R-124和PDT对细胞活力的影响;设计合成mi R-124的完整启动子,并按生物信息学预测的p53wt的结合位点设计截短的启动子报告质粒,借助双荧光素酶实验在p53wt RKO和p53+/+HCT116细胞中筛选并验证具体的结合位点。3.在细胞和组织两个层面研究mi R-124和i ASPP的表达水平;通过慢病毒包装技术获得慢病毒LV-sh-i ASPP,然后在RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116细胞中验证LV-sh-i ASPP与PDT对细胞活力的影响;设计合成i ASPP基因的3’-UTR完整启动子,并按生物信息学预测的mi R-124结合位点设计突变的3’-UTR报告质粒,借助双荧光素酶实验在293细胞中筛选并验证具体的结合位点。结果:1.3株p53mut结肠癌细胞活力明显高于3株p53wt细胞株;细胞实验PDT处理组p53mut HT29细胞株24小时和48小时的细胞活力均优于p53wtRKO细胞株,p53-/-HCT116细胞株24小时和48小时的细胞活力均优于p53+/+HCT116细胞株;动物实验PDT处理组,p53mutHT29细胞成瘤后肿瘤体积同期均大于p53wtRKO细胞成瘤后肿瘤体积,p53-/-HCT116细胞成瘤后肿瘤体积同期均大于p53+/+HCT116细胞成瘤后肿瘤体积。2.mi R-124在结肠癌p53mut组织中、p53突变的结肠癌细胞及p53表达缺失的结肠癌细胞中均低表达;mi R-124可以降低HT29和RKO、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116细胞活力,p53突变或缺失结肠癌细胞较p53wt细胞对PDT和mi R-124联合处理表现出一定的耐受性;p53可以与mi R-124启动子区域的B、C两个位点作用,并促进mi R-124的表达。3.p53mut三株细胞中mi R-124表达水平均低于p53wt三株细胞,而i ASPP表达水平相反;18例组织样品中,p53表达水平越高则mi R-124表达水平越高,i ASPP表达水平越低;干扰i ASPP可以降低结肠癌细胞活力,p53突变或缺失结肠癌细胞较p53wt细胞对PDT和sh-i ASPP联合处理表现出一定的耐受性;mi R-124与i ASPP 3’-UTR的两个位点都有作用,可以下调i ASPP的表达。结论:1.PDT处理可以明显杀伤结肠癌细胞降低其细胞活力,而p53突变或缺失的结肠癌细胞株对PDT表现出一定的耐受性。2.p53wt可以与mi R-124启动子区域两个位点发生相互作用,并激活mi R-124启动子的转录活性,上调mi R-124的表达水平协同PDT降低结肠癌细胞活性。3.mi R-124可靶向调控下游靶基因i ASPP;干扰i ASPP的表达可协同PDT降低结肠癌细胞活力;p53wt-mi R-124-i ASPP通路可介导PDT杀伤结肠癌细胞。