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【研究背景】肿瘤坏死因子TNF-α具有杀伤和诱导肿瘤细胞生存的双重作用,受体相互作用蛋白1（RIP1）是TNF-α下游信号通路的关键分子,参与决定TNF-α诱导的细胞生存或死亡通路。本课题组前期研究工作发现在体内和体外实验均表明TNF-α-RIP1具有促进胆囊癌细胞增殖和侵袭的作用。而RIP1作为启动细胞生存及死亡的开关,如何引导TNF-α促胆囊癌细胞凋亡,目前相关研究未见报道。细胞凋亡抑制蛋白（c IAPs）是重要的E3泛素连接酶,c IAPs降解后,将导致RIP1与caspase-8和FADD结合,激活细胞的凋亡通路。鉴于此,本研究拟应用c IAPs抑制剂“Smac模拟物”,引导TNF-α促胆囊癌细胞凋亡;并从RIP1的完整性、RIP1 K48多聚泛素化以及RIP1不同的复合体存在形式,研究其产生凋亡的机制;通过动物实验探寻TNF-α联合Smac模拟物用于诱导胆囊癌细胞凋亡的可行性,研究结果将为胆囊癌的靶向治疗提供新的治疗方案。研究分以下三部份,统计分析使用Graph Pad Prism 7.0和SPSS 13.0.1软件进行处理,所以数据均采用均数±标准差（Mean±SD）表示,多组间均数比较采用方差分析（ANOVA）。第一部份Smac模拟物引导TNF-α抑制胆囊癌细胞增殖和促进细胞凋亡应用Smac模拟物抑制SGC-996、NOZ胆囊癌细胞c IAPs,实验均设3组:NC组、Smac模拟物组（S组）、TNF-α+Smac模拟物组（T+S组）,作以下检测1胆囊癌细胞增殖情况CCK-8实验检测结果显示:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（0.246±0.024）较NC组（1.589±0.155）及S组（1.605±0.119）增殖能力显著下降（均P0.05,差异无统计学意义;NOZ胆囊癌细胞试验获得相似结果。细胞单克隆形成实验结果显示:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（38.000±10.440）较NC组（119.667±3.512）及S组（119.333±8.505）细胞集落数显著减少（均P0.05,差异无统计学意义;NOZ胆囊癌细胞试验获得相似结果。以上结果表明:Smac模拟物抑制c IAPs后TNF-α可抑制胆囊癌细胞增殖。2胆囊癌细胞凋亡情况流式细胞凋亡检测实验,结果显示:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（13.797±2.041）较NC组（3.837±1.645）及S组（3.910±0.660）细胞凋亡比例显著增加（均P0.05,差异无统计学意义;NOZ胆囊癌细胞试验获得相似结果。应用Western blot实验检测凋亡相关蛋白在胆囊癌细胞的表达,提取细胞蛋白,应用相应抗体检测cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白,结果显示,cleaved caspase-8蛋白:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（1.080±0.043）较NC组（0.409±0.073）及S组（0.273±0.150）表达均显著增加（均P0.05,差异无统计学意义。cleaved caspase-3蛋白:T+S组（1.199±0.121）较NC组（0.148±0.124）及S组（0.211±0.048）表达显著增加（均P0.05,差异无统计学意义。cleaved PARP蛋白:T+S组（0.960±0.033）较NC组（0.107±0.143）及S组（0.202±0.083）表达显著增加（均P0.05,差异无统计学意义。NOZ胆囊癌细胞上述蛋白检测试验均获得相似结果。以上结果表明:Smac模拟物未能诱导胆囊癌细胞的凋亡,但其可引导TNF-α促胆囊癌细胞高表达cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved PARP等凋亡蛋白,促进细胞凋亡。第二部份Smac模拟物引导TNF-α促胆囊癌细胞凋亡的机制实验设3组:NC组、Smac模拟物组（S组）、TNF-α+Smac模拟物组（T+S组）,作以下检测1检测RIP1 m RNA和蛋白表达量通过RT-q PCR实验检测RIP1 m RNA表达:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（1.657±0.143）较NC组（1.000）及S组（1.206±0.101）表达未见明显减少;而S组与NC组比较,RIP1 m RNA表达未见明显减少,P>0.05,差异无统计学意义。NOZ胆囊癌细胞试验获得相似结果。通过Western blot实验检测RIP1蛋白:SGC-996胆囊癌细胞T+S组（0.100±0.004）RIP1蛋白较NC组（0.892±0.205）及S组（0.975±0.271）表达显著减少（均P0.05,差异无统计学意义。NOZ胆囊癌细胞获得相似结果。以上结果表明:Smac模拟物+TNF-α导致胆囊癌细胞RIP1蛋白减少与蛋白的降解有关,与基因转录无关,提示RIP1蛋白完整性被破坏。2免疫共沉淀实验检测RIP1 K48多聚泛素化各组细胞经相应药物处理6小时后,收集细胞,在裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解液与RIP1抗体和蛋白A/G琼脂糖凝胶在4°C孵育过夜。免疫沉淀反应后,通过免疫印迹分析RIP1 K48多聚泛素化表达。IP（RIP1）实验中SGC-996胆囊癌细胞,T+S组（180684.800±10508.222）RIP1 K48位点多聚泛素化蛋白灰度值较NC组（105709.593±43573.571）及S组（113574.300±21305.339）表达明显增加（均P0.05,差异无统计学意义。NOZ胆囊癌细胞获得相似结果。表明:Smac模拟物+TNF-α导致胆囊癌细胞RIP1 K48多聚泛素化。3免疫共沉淀实验检测RIP1复合体存在形式各组细胞经相应药物处理6小时后,收集细胞,在裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解液与RIP1抗体和蛋白A/G琼脂糖凝胶在4°C孵育过夜。免疫沉淀反应后,通过免疫印迹分析信号复合体I和信号复合体Ⅱ各组分表达。IP（RIP1）实验中SGC-996胆囊癌细胞T+S组（26064.260±6758.389）信号复合体I中TRAF2蛋白灰度值较NC组（44563.217±7140.576）及S组（49825.120±6035.878）明显减少（均P0.05,差异无统计学意义。SGC-996胆囊癌细胞T+S组（27710.983±10895.659）信号复合体I中TRADD蛋白灰度值较NC组（44106.193±3098.337）及S组（45598.597±2786.985）明显减少（均P0.05,差异无统计学意义。同时NOZ胆囊癌细胞可观察到同样的免疫共沉淀实验结果。表明:Smac模拟物+TNF-α导致胆囊癌细胞形成复合体I减少。IP（RIP1）实验中SGC-996胆囊癌细胞T+S组（49814.367±5689.322）信号复合体II中caspses-8蛋白灰度值较NC组（20597.270±7111.896）及S组（31922.900±9510.947）明显增加（均P0.05,差异无统计学意义。SGC-996胆囊癌细胞T+S组（47088.091±5881.572）信号复合体II中FADD蛋白灰度值较NC组（19737.123±6988.663）及S组（30722.834±4613.997）明显增加（均P0.05,差异无统计学意义。同时NOZ胆囊癌细胞可观察到同样的免疫共沉淀实验结果。表明:Smac模拟物+TNF-α导致胆囊癌细胞形成复合体II增加。综合上述结果表明:Smac模拟物引导TNF-α促胆囊癌细胞凋亡与RIP1降解、RIP1 K48多聚泛素化及形成复合体I减少、复合体II增加有关。第三部份TNF-α联合Smac模拟物对胆囊癌移植瘤生长及凋亡的影响构建SGC-996和NOZ胆囊癌移植瘤模型,约两周成瘤,皮下成瘤形成后,每隔3天应用游标卡尺测量瘤块的最长径和最短径,计算肿瘤体积。按肿瘤大小平均分组,每隔3天腹腔注射相应药物,NS（PBS液）、Smac模拟物以及TNF-α+Smac模拟物,定期观察小鼠生存情况、负瘤大小。待移植瘤最大长至2000mm~3时,对小鼠进行安乐死,无菌条件下解剖裸鼠,完整剥离肿瘤,对肿瘤组织称重。并将标本制成石蜡切片,进行后续实验。1胆囊癌移植瘤生长情况:胆囊癌移植瘤体积,SGC-996胆囊癌移植瘤T+S组（329.289±132.349）较NC组（1099.823±574.367）及S组（868.176±289.745）增长明显缓慢（均P0.05,差异不具统计学意义。胆囊癌移植瘤重量,SGC-996胆囊癌移植瘤T+S组（0.303±0.153）明显小于NC组（1.340±0.567）及S组（0.940±0.516）,均P0.05,差异不具统计学意义。NOZ胆囊癌移植瘤试验获得相似结果。结果表明:Smac模拟物+TNF-α可抑制胆囊癌移植瘤生长。2胆囊癌移植瘤细胞凋亡情况:HE染色:胆囊癌移植瘤T+S组和S组可见成片的胆囊癌细胞出现核固缩、染色质浓聚和核破裂征象;在相同放大倍数的视野下,T+S组与NC组及S组比较,胆囊癌细胞计数明显减少,细胞间隙大,细胞生长明显受抑制。TUNEL实验:相同倍数视野下SGC-996胆囊癌移植瘤细胞T+S组（91.614±2.960）凋亡率较NC组（1.489±0.207）及S组（32.163±2.017）显著增加（均P<0.0001）;同时NC组与S组比较P<0.0001,差异具统计学意义。NOZ胆囊癌移植瘤细胞试验获得相似结果。免疫组化实验:相同倍数视野下SGC-996胆囊癌移植瘤细胞T+S组（0.029±0.002）cleaved caspase-3较NC组（0.010±0.001）及S组（0.017±0.001）明显增加（均P<0.001）;同时NC组与S组比较P<0.001,差异具统计学意义。NOZ胆囊癌移植瘤细胞试验获得相似结果。以上结果表明:Smac模拟物+TNF-α可抑制胆囊癌移植瘤生长,促进胆囊癌移植瘤细胞凋亡。【结论】1 Smac模拟物引导TNF-α抑制胆囊癌细胞增殖,诱导胆囊癌细胞凋亡。2 Smac模拟物引导TNF-α促进胆囊癌细胞凋亡与RIP1降解、RIP1 K48多聚泛素化、及形成RIP1复合体I减少、RIP1复合体II增加有关。3 Smac模拟物+TNF-α可抑制胆囊癌移植瘤生长,促进胆囊癌移植瘤细胞凋亡。