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衰老是叶片生长发育经历的最后阶段,是植物根据叶片内部因素(如年龄、生长发育状态、代谢)以及外部环境条件(如光、温度、胁迫)主动激发并进行严格调控的复杂过程。对于一年生植物来说,衰老也意味着植株会走向死亡,衰老叶片的细胞内物质被有序降解,营养物质被重新分配并转运至生长部位如幼嫩的叶片、贮藏器官及正在发育的种子,这一过程对植物的生存以及作物产量的形成十分关键。一般来说,在最佳生长条件下,叶片衰老是以年龄依赖的方式进行的,往往从较为成熟叶片的叶尖开始。然而,多变的环境光照条件影响了叶片衰老的起始及进程,如低比率的红光/远红光(R/FR,red light/far-red light)(遮荫环境)、远红光或长期黑暗加速叶片衰老进程,而高比率的红光/远红光或红光照射抑制这一进程。植物感受外界环境光信号并整合自身内部年龄因素进而启动并控制叶片衰老的分子机制尚不明晰。叶片衰老过程涉及大量衰老相关基因SAGs(SENESCENCE-ASSOCIATED GENES)的表达变化,如SAG12、SAG13、SAG29、SAG101、SAG113,并受多个转录因子家族(如NAC、WRKY)调控。WRKY家族是植物特有的两个数量最大的转录因子家族之一,其中多个基因参与了对叶片衰老的调控。拟南芥WRKY28是WRKY转录因子家族的一员,在水杨酸合成、植物防御反应以及生殖系特化中发挥重要作用,但其在叶片衰老上的作用还未见报道。拟南芥FHY3(FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3)及其同源蛋白FAR1(FAR-RED IMPAIRED RESPONSE1)是植物光敏色素phyA介导的远红光信号转导途径中的重要转录因子,广泛调控了拟南芥的多个生长发育过程,但其在叶片衰老过程中的生理及分子功能还有待发掘。本研究发现拟南芥FHY3/FAR1负调控年龄及光信号介导的叶片衰老,并对其机理进行了研究,主要结果如下:(1)我们观察了fhy3-4突变体的表型,发现与野生型No-0相比,fhy3-4在不同发育阶段都表现明显的提前衰老表型。为进一步确定fhy3突变体的表型是由于FHY3功能缺失导致的,我们观察了互补株系FHY3pro:FHY3-YFP fhy3-4(FHY3-YFP)及FHY3pro:FHY3-GR fhy3-4(FHY3-GR)的叶片衰老表型。结果表明,FHY-YFP及FHY3-GR的表达在很大程度上恢复了fhy3-4的早衰表型,说明FHY3负调控了年龄介导的叶片衰老。(2)FHY3负调控了光及植物激素调控的叶片衰老。表型分析发现,与野生型相比,在高比率R/FR光照条件及低比率R/FR光照条件下,fhy3-4、far1-2及fhy3-4 far1-2突变体均表现为早衰。但far1-2及fhy3-4 far1-2突变体在高比率R/FR光照条件下的早衰表型比其在低比率R/FR光照条件下的表型更加明显,说明FHY3及FAR1在光调控的叶片衰老中发挥重要作用,但主要介导了高比率R/FR对叶片衰老的抑制作用。不同激素处理离体叶片的表型分析表明,FHY3参与了植物激素乙烯、茉莉酸及水杨酸对叶片衰老的调控。(3)FHY3直接结合在WRKY28基因启动子上并在叶片衰老过程中抑制其表达。启动子分析发现,WRKY28的启动子区域存在两个典型的FHY3/FAR1结合顺式作用元件(FBS)。酵母单杂交及染色质免疫共沉淀实验表明,FHY3/FAR1直接结合在WRKY28的启动子FBS区域。原生质体瞬时转化及荧光定量PCR实验表明,在叶片衰老过程中,FHY3负调控了WRKY28的基因表达。(4)WRKY28正调控叶片衰老,FHY3通过抑制WRKY28基因表达进而抑制了叶片衰老。我们构建了WRKY28过量表达株系,发现过量表达WRKY28促进叶片衰老,说明WRKY28是一个叶片衰老正调控因子。同时我们利用CRISPR-Cas9构建了wrky28及fhy3-4 wrky28突变体株系,发现wrky28突变体叶片衰老明显延迟,fhy3-4 wrky28株系恢复了fhy3-4的早衰表型,说明FHY3通过控制WRKY28转录水平调控了叶片衰老。(5)我们利用fhy3-4与水杨酸合成关键基因ICS1/SID2的突变体sid2及水杨酸代谢关键基因S3H过量表达株系S3H-ox进行杂交得到fhy3-4 sid2及fhy3-4 S3H-ox株系,发现在fhy3-4中突变SID2或过量表达S3H均可在很大程度上恢复fhy3-4的早衰表型,说明FHY3及WRKY28通过控制水杨酸水平调控了叶片衰老。进一步,离体叶片的激素处理表型分析发现,WRKY28过量表达导致拟南芥叶片对水杨酸诱导的叶片衰老更加敏感,而WRKY28基因突变则在很大程度上恢复了fhy3-4突变体对水杨酸诱导的叶片衰老的敏感表型。上述结果说明FHY3通过抑制WRKY28的基因表达进而调控了水杨酸的合成、积累及响应,从而调控了叶片衰老。(6)表型分析发现,FHY3及WRKY28在高比率R/FR光照及低比率R/FR光照调控的叶片衰老中均发挥功能,但FHY3-WRKY28转录调控元件主要介导了高比率R/FR对叶片衰老的抑制作用。(7)荧光定量PCR分析发现FHY3及WRKY28的表达在叶片发育过程中逐渐升高。为进一步在蛋白水平上分析FHY3的表达模式,我们观察了转基因株系FHY3pro:FHY3-LUC fhy3-4(FHY3-LUC)中LUC的蛋白积累,发现FHY3在转录及转录后水平上均受年龄信号诱导。荧光定量PCR分析及表型分析发现,FHY3-WRKY28转录模式同样存在于幼苗期,且相对于低比率的R/FR光照条件,其在高比率R/FR光照条件对叶片衰老的抑制中发挥更重要的作用。本研究揭示了FHY3及WRKY28在叶片衰老调控中的生理及分子功能,解析了植物整合环境光信号及内部年龄信号以启动及控制叶片衰老的分子机制。