目前,抗生素的过度使用使多重耐药性细菌菌株日益增多,对人类的健康及公共卫生构成了巨大威胁。因此,新型抗菌制剂的发现及生产具有越来越重要的意义。抗菌肽（AMPs）作为生物体内天然存在的免疫活性物质,能够很好地避免细菌多重耐药性的产生。由于天然AMPs分离提取困难,而且目前使用重组DNA技术生产AMPs的策略通常涉及亲和层析和蛋白酶,步骤繁琐且价格昂贵。为了解决以上问题,本研究采用了一种无需色谱和蛋白酶的系统:ELP-intein自断裂系统制备抗菌肽。其中,利用ELP（类弹性蛋白多肽）对温度的可逆相变行为纯化融合蛋白,再通过p H敏感性的Mtu Rec AΔI-CM内含肽的C-端断裂获得目的AMPs。通过查阅文献选择了四种AMPs:arasin-like Sp、Brevinin-2、HD-5和LCNKL2,其中arasin-like Sp作为一种水生抗菌肽,对哈氏弧菌等水生致病菌有很好的抗菌活性;而Brevinin-2、HD-5和LCNKL2可有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。基因合成后分别克隆到含ELP和Mtu Rec AΔI-CM内含肽的表达载体中,即构建了重组表达质粒p ET-ELP-I-arasin-like Sp、p ET-ELP-I-Brevinin-2、p ET-ELP-I-HD-5和p ET-ELP-I-LCNKL2。以大肠杆菌作为宿主细胞,融合蛋白均以可溶的形式表达。通过ELP纯化和内含肽的C-端断裂成功获得了arasin-like Sp、Brevinin-2和HD-5,产量分别为～4 mg/L、～5 mg/L和～4.6 mg/L。抗菌实验表明,纯化的arasin-like Sp、Brevinin-2和HD-5均有抗菌活性。FE-SEM和PI染色分析表明,各抗菌肽处理后均可以改变细菌的形态和膜通透性。溶血实验结果表明,arasin-like Sp、Brevinin-2和HD-5对小鼠红细胞均表现出低溶血性,即利用该系统制备的AMPs在未来有潜力成为一种有效的抗生素替代品。该方法无需采用价格昂贵且容易产生标签残留的色谱层析进行纯化,仅通过简单的硫酸铵沉淀和p H的改变就能获得目标AMPs,且纯化的AMPs保留了其原有的活性,既高效又节约成本,为AMPs的规模化生产奠定了基础。与此同时,由于AMPs具有较好的抗菌活性和抗生物膜作用,为治疗术后或其他伤口引起的微生物感染指明了方向。为了拓展AMPs在该方面的应用,将AMPs与蛛丝蛋白融合,拟开发一种含AMPs的新型无药材料,以预防或减少感染的风险。通过本实验室对蛛丝纤维的研究,在已获得具有较好机械性能的嵌合蛛丝蛋白Flag-Ac Sp1（FAc）的基础上,将上述HD-5融合在嵌合蛛丝蛋白FAc的下游,并利用thrombin蛋白酶识别位点将两者进行分隔。经大肠杆菌表达后,重组蛋白位于上清中,通过镍柱的非变性纯化获得重组蛋白,经手工拉丝制备重组蛋白丝纤维后测定其机械性能,结果显示,重组蛋白6×His-SUMO-FAc-HD-5丝纤维虽然没有具备FAc丝纤维卓越的断裂强度和杨氏模量,但它保持了FAc丝纤维良好的韧性,并表现出出色的断裂应变能力。该重组蛋白经thrombin蛋白酶消化以及反镍柱纯化后,最终获得了HD-5。通过测定重组蛋白6×His-SUMO-FAc-HD-5和HD-5的抗菌活性,结果表明它们对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均形成了抑菌圈,这一定程度上说明了利用镍柱纯化出来的抗菌肽具有抗菌活性。综上所述,本研究利用ELP-intein自断裂系统在大肠杆菌中成功获得了抗菌肽,为以后抗菌肽的大规模生产提供了一个经济且有效的途径。另外,还通过大肠杆菌成功表达出含有抗菌肽HD-5的重组蛋白蛛丝纤维,为抗菌肽在抗菌涂层、伤口敷料上的进一步研究奠定基础。