研究背景肾母细胞瘤或称肾胚胎瘤,又称Wilm’s瘤（WT）,是小儿最常见的恶性实质性肿瘤之一。目前认为分期及分型是影响预后的重要因素,与肿瘤大小无关。早期诊断对肾母细胞瘤的治疗以及患儿的预后具有重大意义。现阶段临床上诊断肾母细胞瘤主要依靠临床症状结合超声、IVU、CT等检查,多数病例虽术前可确诊,但是因未能及早发现就诊而误失治疗时机影响预后。因此,寻找一种可行的能够早期诊断肾母细胞瘤的方法对其治疗和预后是十分重要的。随着蛋白质组学的发展,理想的血清蛋白质标志物作为早期筛查和诊断指标值得关注和研究。蛋白质组学技术可高通量快速的筛检肿瘤不同发生阶段基因表达的蛋白质表达谱,从而发现大量有诊断价值的蛋白质标志分子,而这些蛋白能够为肿瘤治疗提供靶点,为早期诊断提供有效肿瘤标志。2002年诞生的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-massspectrum,SELDI-TOF-MS）蛋白质芯片技术已广泛用于各类疾病特异性生物标志物的检测和筛选,并取得了一系列突破性进展。SELDI-TOF-MS技术作为一项新的蛋白质组学研究方法,具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点,通过结合MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS等技术已经鉴定出了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等肿瘤血清中的相关特异性蛋白。迄今为止对小儿肾母细胞瘤的相关特异性蛋白的鉴定尚未见文献报道。本研究应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检测肾母细胞瘤患儿手术前后及正常小儿血清蛋白质组,筛选出特异的蛋白质标志物,并用质谱鉴定技术对筛选出特异的蛋白质标志物进行鉴定。研究目的筛选肾母细胞瘤特异性血清蛋白质标志物并对其进行鉴定,以期确定其作为肾母细胞瘤血清学诊断和预后监测的特异标志物。材料与方法1.临床资料血清标本130例均来自郑州大学第一附属医院小儿外科,其中肾母细胞瘤术前标本30例（Ⅰ期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例）,术后2周24例（行根治术21例、行姑息切除术3例）,1例于术后两月死亡,术后3个月和6个月各23例。正常对照组30例来自门诊体检的健康小儿,男21例,女9例,平均年龄（2.6±0.1）岁。30例肾母细胞瘤标本均经免疫组化和2位以上病理学教授证实,其中男21例,女9例,年龄24 d～10岁,平均年龄（2.8±0.1）岁;进行手术后配对研究的24例患儿中男16例,女8例,平均年龄（2.2±0.1）岁,术前均未接受放化疗。正常对照组与肾母细胞瘤组年龄性别相配对。外周静脉血标本均于清晨空腹时抽取,室温下静置1 h后3000 r/min离心10min,收集血清样本,储存于-80℃保存备用。2.主要试剂和仪器3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）,尿素,二硫苏糖醇（DTT）,NaAC,芥子酸（SPA）,胰蛋白酶均购自美国Promega公司。Ciphergen PBSⅡ⁺ SELDI-TOF-MS和WCX2蛋白质芯片购自美国Ciphergen公司。乙腈、a-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、胰岛素、细胞色素C、碘乙酰胺（IAM）、NH₄HCO₃均购自美国Sigma公司。SHIMADZU LC-10Avp高效液相色谱（HPLC）仪购自日本岛津公司。基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱（AXIMA-CFRTM plus MALDI-TOF-MS）购自英国Kratos Analytical公司。离心浓缩仪、液质联用质谱仪（LC-MS/MS）均购自美国Thermo electron公司。3.实验方法3.1 SELDI蛋白质芯片操作:血清标本冰浴解冻,4℃离心;取96孔板置冰盒上,每孔加U9（9 MUrea,2%CHAPS,1%DTT）10 ul,血清5 ul,4℃层析柜600 r/min振荡30 min。震荡结束前15 min做芯片预处理,芯片装入Bioprocessor中,记录芯片号;每孔加醋酸钠（100mmol/L PH 4）200 ul,层析;U9处理后的96孔板置冰上,排枪加醋酸钠185 ul,层析;取已处理的样本100ul加入到芯片上,层析,甩去残液,快速拍干。加醋酸钠200 ul,振荡,甩掉,拍干。200 ul去离子水200 ul冲洗、甩干。芯片风干后,每孔分两次加入50%饱和SPA 1 ul,干燥后上机待测。3.2差异蛋白质峰的纯化:于-80℃冰箱中取出血清样本,冰水浴中解冻。解冻后,取血清100μl,加入350μl超纯水,再加入700μl纯乙腈。将上述混合液置入-20℃冰箱中,30 min后取出,离心10 min（13000 r/min）,上清液移入新试管置入SPD SpeedVac中冻干约20 min。将冻干后的样品上样至HPLC中。收集不同时间的纯化液。将纯化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中冻干至约20μl。将上述样品与CHCA各取1.5μl,两者混合后点样至MALDI靶板,待干。同时用细胞色素C（相对分子质量12361.96）+CHCA和胰岛素（相对分子质量5734.51）+CHCA校样。将靶板置入MALDI-TOF-MS中检测,找出SELDI-TOF-MS所筛质荷峰值的特异样本。3.3酶解、质谱分析及数据库检索:将特异蛋白质样品加超纯水至容积40μl,再加入配好的浓度为0.1 mol/L的DTT溶液4μl后,置于37℃温水中水浴1h。向44μl的溶液中加入1.6μl的IAM后避光放置1 h。再向45.6μl的溶液中依次加入1.6μl的1 mol/L的DTT溶液、150μl的0.1 mol/L的NH4HCO3溶液和2μl的胰蛋白酶,然后37℃温水过夜。取经酶解后的蛋白液上样至毛细色谱柱后,采用LC-MS/MS进行串联质谱分析,分析得到的肽质量指纹图谱（PMF）使用SEQUST检索程序查询Bioworks公司提供的蛋白质序列数据库。4.数据收集与处理用已知分子量的蛋白芯片将SELDI-TOF-MS系统校正到分子量误差＜0.1%。将结合好蛋白质的WCX2蛋白质芯片用质谱阅读仪分析。分析参数:激光强度为170,灵敏度为6,每个样本收集总点数140次。收集数据范围1000～30000,优化范围2000～20000。以质控血清作重复性检测,其峰值大小和强度变异系数为0.05%和19.7%。数据用Proteinchip Software 3.1校正。ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包分析,离散小波分析去除噪音,减掉基线。用局部极值的方法找出样本各自的峰,并过滤掉信噪比小于2的峰。以10%为最小阈值做聚类分析,将各个样本中m/z的差异小于0.3%的峰聚为一类。支持向量机分类器设置:采用径向基核函数,Gamma值设为0.6,罚分函数（C）设为19。特征向量的选择采用统计过滤结合模型依赖性筛选方法,建立判别模型,用留一法交叉验证评估模型的判别效果。采用判别分析方法处理质谱数据对经S处理得到的结果进行验证。5.统计学处理质谱原始数据经过滤噪音,聚类分析处理后,对初步筛选出的质荷比峰数据做Wilcoxon秩和检验。检验标准取α=0.01。结果1.SELDI-TOF-MS检测:术前组和正常小儿组的质谱数据经过初步过滤筛选和统计分析后得到P值小于0.01的m/z峰11个,从差异显著蛋白质峰的任意组合中,采用SVM筛选出预测值的youden指数（阳性率与阴性率之差）最高的组合模型,筛出m/z位于6455.5和6984.4的蛋白质标志物2个,在肾母细胞瘤组低表达（强度为1029.2±364.1、297.4±125.6）,正常小儿组高表达（强度为2108.3±837.2,753.4±225.8）,差异有统计学意义（P＜0.01）。经留一法交叉检测,在测试集上判别该两个标志物组合模型的特异性为100%,敏感度为100%。肾母细胞瘤手术前后组比较筛选到差异最显著的m/z位于9190.8的蛋白质标志物,在术前组血清中低表达（强度为283.4±153.9）,术后组中呈高表达（强度为5973.6±656.7）,差异有统计学意义（P＜0.01）;术后组和正常小儿组（表达强度为6231.0±519.4）间差异无统计学意义（P＞0.01）。2.差异蛋白质峰的纯化:将6455.5、9190.8高表达的正常小儿血清分离纯化后共收集到25管不同组分的蛋白质液。经MALDI-TOF-MS检测,发现两管蛋白质纯化样本分别是相对分子质量6455.5和9190.8的特异蛋白质。3.质谱分析及数据库检索:酶解上述两管的蛋白质样品后,采用LC-MS/MS测定该蛋白质的酶解肽段,将检测得到的PMF经过SEQUST检索程序查询Bioworks公司提供的蛋白质序列数据库,查得其对应可能的蛋白质为:6455.5为载脂蛋白CⅢ,所检测到的肽段氨基酸序列与数据库中的人APO CⅢ序列匹配率为56.6%;9190.8为触珠蛋白（Hp）,所检测到肽段氨基酸序列与数据库中人Hp序列匹配率为47.5%。结论检测血清中载脂蛋白CⅢ和触珠蛋白含量可能成为肾母细胞瘤的血清学诊断、恶性度分级和预后监测指标,值得进一步研究与应用。