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背景和目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)为炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)的一种主要疾病类型,好发于青壮年,且容易反复发作,严重影响着患者的生活质量。目前已有的药物主要作用为控制肠道炎症活动和调节机体免疫,并不能达到粘膜愈合的效果。而粘膜愈合是治疗该疾病的根本目标。肠粘膜的修复始于肠道干细胞(ISCs)的分化与增殖,近年来用干细胞移植治疗IBD已经显现出一定的效果。但是肠道干细胞的分离与培养技术复杂,不利于被广泛推广使用。骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSCs)因其取材方便且具有多向分化潜能而备受关注。但是如何将BM-MSCs在体外扩增分化为肠道干细胞并有效送达受损肠段,以及相关机制均有待于探索。基于相关文献阅读,本研究拟在体外应用生长因子和miR-17,实现BM-MSCs →内胚层细胞→肠干细胞逐步分化,然后将GFP标记的类肠道干细胞,通过保留灌肠移植治疗实验性结肠炎,观察其归巢定植以及对肠道炎症的改善和粘膜修复的效果。第一节逐步诱导BM-MSCs分化为类肠道上皮干细胞目的:建立体外培养体系,将BM-MSCs逐步诱导为类肠道干细胞方法:提取骨髓间充质细胞,传至第三代,接种于6孔细胞培养板,加入不同浓度的Activin A(0,1,5,10,20,100ng/mL),培养5天,检测内胚层特异性基因Foxa2和Sox17表达变化,进而得出最优的Activin A浓度。然后加入最优浓度的Activin A,重复上述5天的培养,加入250ng/mLFGF2,培养4天,检测肠道干细胞特异性基因Lgr5和Musashi-1的表达量。结果:qRT-PCR,WB证实Activin浓度在5ng§/mL时,Sox和Foxa2表达量均最高。Activin A诱导5天后,Sox17和Foxa2的表达量显著上升。FGF2处理后,qRT-PCR和WB证实Lgr5和Musashi-1的表达量逐步上升,且差异具有统计学意义。流式细胞仪分析表明Lgr5+的细胞比例为30.06%。结论:BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下,先转变为Foxa2+和Sox17+的内胚层细胞,进而再转变为Lgr5+和Musashi-1+的类肠道干细胞。第二节miR-17协同生长因子促进BM-MSCs向类肠道干细胞分化目的:阐述miR-17在BM-MSCs向类肠道干细胞分化过程中的作用及相关机制方法:BM-MSCs按第一部分所述,在5ng/mL Activin A诱导为内胚层细胞,先成功转染miR-17,然后协同250ng/mLFGF2,诱导4天,检测Lgr5、Musashi-1和靶基因E2F1和WIFI以及β-catenin的表达量。免疫荧光和流式细胞仪进一步检测类肠道干细胞的表达比例,最后利用EGF诱导类肠道干细胞,观察其在体外是否可以分化为肠上皮细胞系。结果:miR-17可以抑制WIF1和E2F1的表达,增强Wnt/β-catenin通路的活性,进而显著提高诱导效率,不仅目的基因Lgr5和Musashi-1表达量上升,而且诱导时间缩短至2天,Lgr5+细胞比例为89.14%。类肠道干细胞在EGF作用下可继续分化为类肠上皮吸收细胞。结论:miR-17具有促进内胚层细胞转变为类肠道干细胞的作用,且其中的机制与激活Wnt/β-catenin通路活性有关。第三节观察GFP转基因的类肠道干细胞移植对DSS诱导的结肠炎的疗效目的:证明体外诱导分化的类肠道干细胞能够参与修复受损的肠粘膜方法:前期急性肠炎模型预实验表明3%DSS溶液成模效果最佳。30只6周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为三组,分别为A(Control)组,B(DSS+PBS)组,C(DSS+ISCs)组。B和C两组小鼠自由饮用3%DSS溶液7天,分别于第7,9天通过保留灌肠注入1 × 106/150ul的细胞悬浮液和等量的PBS溶液。实验第14天,每组各处死5只小鼠,取肠组织做病理切片和冰冻切片,免疫荧光检测移植细胞定位。qRT-PCR和CBA法测肠组织和血清的炎性因子水平。一个月后,处理剩余小鼠,免疫荧光观察肠上皮细胞Muc2和CK-18表达。结果:在整个实验周期中,C组小鼠和B组相比较,体重减轻程度更小,恢复更快,未出现死亡小鼠,病理切片表明结肠受损程度更小,肠组织和全身炎症水平更低。免疫荧光检测可以观察到GFP细胞主要定植在肠道中下段,且干细胞具有归巢效应,可以定植在隐窝和肠上皮处,一个月后可分化为肠上皮细胞。结论:体外诱导分化的类肠道干细胞在实验性结肠炎小鼠肠道内定植,可以归巢到肠道损伤部位,修复受损肠组织,减轻肠道和全身炎症反应。结论1.BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下转变为类肠道干细胞;2.miR-17通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BM-MSCs转变为类肠道干细胞3.体外诱导分化的类肠道干细胞可定植在受损的肠粘膜,改善肠道的炎症状态。