论文部分内容阅读
背景与目的乳腺癌是严重威胁女性健康的疾病之一,近20年来其发病率呈明显上升趋势。不仅与原癌基因的激活、抑癌基因的突变或缺失有关,还与肿瘤细胞增殖和凋亡之间动态平衡发生破坏有关。随着肿瘤分子生物学的飞速发展,多种分子生物学指标被提出。原癌基因Bmi-1是近期被提出的生物学指标,Bmi-1基因是多梳基因(polycomb group genes, PCG)家族中重要成员之一,PCG是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子,其全名为B细胞特异的莫洛尼白血病病毒插入位点1基因(B-cell specific moloney leukemia virus integration site 1,Bmi-1)。Bmi-1基因在多种肿瘤形成过程中起重要作用,在细胞生长、增殖和干细胞的增殖、分化与衰老中发挥重要的作用。有研究指出Bmi-1基因能使乳腺上皮细胞永生化,表明Bmi-1基因在乳腺癌的发生中起重要作用。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶,它具有逆转录酶活性,能以自身的RNA为模板,合成端粒重复序列,稳定端粒的长度,被认为是保持染色体完整性的一种机制。所以肿瘤细胞的无限增殖与端粒酶的存在是有很大关系的,正常情况下随细胞分裂,端粒酶进行性缩短,造成基因缺失,从而诱发细胞凋亡。有报道指出,Bmi-1的过度表达能激活端粒酶逆转录酶(hTERT)的转录和诱导端粒酶的活性,Bmi-1诱导端粒酶活性使细胞寿命延长和永生化。但在药物干预下乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中原癌基因Bmi-1和端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达变化及其与细胞凋亡之间关系的研究少见报道。本课题通过5-FU对乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞的干预来分析原癌基因Bmi-1和hTERT的表达变化及其与细胞凋亡的关系,探讨它们在乳腺癌发生、发展过程中的作用。为乳腺癌的临床治疗提供理论依据。方法1.细胞的培养与分组：将乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞常规培养,当细胞进入对数生长期时,将细胞随机分为5-FU处理组(实验组)和对照组。处理组设立四个浓度亚组,分别以(0.01μg/ml、0.1μg/m1、1μg/ml、10μg/ml)浓度的5-FU干预48h和72h；对照组用培养基代替5-FU,其余同5-FU处理组。2.MTT法：MTT法检测用不同浓度的5-FU (0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)干预48h、72h后,对乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞的增殖抑制情况,并确定所选用的药物浓度。3. TUNEL法、流式细胞技术：检测1μg/ml、10μg/ml 5-FU干预48h、72h后乳腺癌MDA-MB-468细胞的凋亡情况。4. RT-PCR方法：采用RT-PCR法检测用5-FU干预48h、72h后乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中原癌基因Bmi-1、hTERT mRNA的表达情况；并分析Bmi-1、hTERT mRNA的表达与细胞凋亡的关系。5. Western Blot法：采用Western Blot法检测用5-FU干预48h、72h后乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中Bmi-1和hTERT蛋白的表达情况；并分析Bmi-1和hTERT蛋白表达与细胞凋亡的关系。6.统计学处理：采用SPSS 13.0软件包进行统计处理,以P<0.05为差异显著；两变量之间的关系分析采用Spearman等级相关分析表示,检验标准以α=0.05为显著性检验水准。结果1.MTT结果显示：5-FU对乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞有明显抑制作用,各实验组与对照组OD值的差异有统计学意义(P<0.05),且在一定浓度范围内存在剂量、时间依赖性。2.TUNEL法结果显示：用1μg/ml、10μg/ml 5-FU干预乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞48h和72h后,细胞凋亡指数增加。实验组与对照组相比差异显著有统计学意义(P<0.05)；3.流式细胞技术结果显示：用1μg/ml、10μg/ml 5-FU干预乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞48h和72h后,细胞凋亡率增加。实验组与对照组相比差异显著有统计学意义(P<0.05)；4. RT-PCR结果显示：用1μg/ml、10μg/ml5-FU干预乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞48h和72h后,Bmi-1和hTERT mRNA表达水平均降低,实验组与对照组Bmi-1和hTERT mRNA表达差异显著有统计学意义(P<0.05)。5. Western Blot结果显示：用1μtg/ml、10μg/ml 5-FU干预48h和72h后,Bmi-和hTERT蛋白的表达水平均降低,实验组与对照组Bmi-1和hTERT蛋白的表达差异显著有统计学意义(P<0.05)。6. Bmi-1、hTERT在乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达相关性经统计学分析显示两者呈正相关(P<0.05)。结论：1.5-FU干预后,乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中Bmi-1和hTERT mRNA及蛋白的表达下降,并呈时间浓度依赖性。2.5-FU可能通过下调Bmi-1和hTERT的表达促进乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞凋亡。