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目的:研究肝癌相关的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在肝癌中表达及其与临床病理参数之间的相关性,初步探讨目标lnc RNA对肝癌细胞增殖、粘附、侵袭、迁移、凋亡及细胞周期的影响,并探究目标lnc RNA与其靶基因的关系,为进一步了解lnc RNA在肝癌发生发展中的作用奠定基础。方法:(1)肝癌相关的lnc RNA的筛选与验证。利用表达谱芯片筛选人的SK-Hep-1-LV5和SK-Hep-1-SMP30中差异性表达的lnc RNA,并在SKHep-1-SMP30细胞中对候选的lnc RNA进行q RT-PCR验证,再进一步在不同肝癌细胞中检测候选lnc RNA的表达,最终筛选出目标lnc RNA GS1-293C5.1;q RT-PCR检测在50例肝癌和配对的癌旁组织中的表达水平,分析其与患者临床病理指标参数之间的相关性;CPAT数据库预测lnc RNA GS1-293C5.1的编码能力;通过细胞质核分离实验确定lnc RNA GS1-293C5.1的亚细胞定位。(2)lnc RNA GS1-293C5.1对肝癌细胞生物学行为影响。在SKHep-1、Huh7、SMMC-7721、Hep3B细胞株中通过慢病毒转染构建lnc RNA GS1-293C5.1稳定过表达细胞株,并通过q RT-PCR验证lnc RNA GS1-293C5.1的表达效率,采用CCK8、细胞克隆形成实验、同质性和异质性粘附实验、Transwell侵袭迁移实验和流式细胞术检测lnc RNA GS1-293C5.1对肝癌细胞增殖、粘附、侵袭、迁移、凋亡和周期改变情况。(3)lnc RNA GS1-293C5.1靶基因的预测和作用机制的初步探讨。生物信息学进行lnc RNA GS1-293C5.1 GO富集和KEGG通路分析,使用Vienna RNA服务器中的RNAfold和RNAcofold预测自由能大小判断lnc RNA GS1-293C5.1与靶基因PON2m RNA的相互关系。QRT-PCR验证靶基因PON2在野生型肝癌细胞和过表达的肝癌细胞中的表达情况,q RT-PCR、Western Bolt分别检测野生型肝癌细胞和过表达的肝癌细胞中PON2的转录和翻译情况。最后再通过q RT-PCR检测肝癌组织中的PON2的表达情况,并分析其表达与lnc RNA GS1-293C5.1的相关性。结果:(1)发现lnc RNA GS1-293C5.1在不同的肝癌细胞中表达存在差异,其在肝癌组织样本中低表达与术后复发关系密切。从课题组前期构建的SK-Hep-1-LV5和SK-Hep-1-SMP30差异性表达谱芯片中筛选出6个候选的lnc RNA,将6个候选的lnc RNA在SK-Hep-1-SMP30细胞中进行q RT-PCR验证,剔除与芯片预测不符的lnc RNA,最终确定lnc RNA GS1-293C5.1作为目标基因,lnc RNA GS1-293C5.1在SK-Hep-1、Huh7、SMMC-7721、Hep3B、Hep G2等5种肝癌细胞相对于正常肝细胞HL-7702的相对表达量分别为:0.42、1.10、0.39、1.06、1.18倍,在肝癌组织中检测到lnc RNA GS1-293C5.1为低表达,相对表达量为0.52。Lnc RNA GS1-293C5.1在肝癌及配对的癌旁组织中相对表达量低与肝癌根除术后复发情况有关。Lnc RNA GS1-293C5.1的蛋白质编码能力很弱,评分为0.00025,细胞质核分离显示GS1-293C5.1主要集中在胞核中,占总量76.21%。(2)lnc RNA GS1-293C5.1影响肝癌细胞的粘附性且对侵袭迁移有抑制作用。本研究成功构建了四种GS1-293C5.1过表达肝癌细胞株SK-Hep-1-GS1-293C5.1、Huh7-GS1-293C5.1、SMMC-7721-GS1-293C5.1、Hep3B-GS1-293C5.1;CCK8、克隆形成实验结果显示lnc RNAGS1-293C5.1对SK-Hep-1、Huh7、SMMC-7721和Hep3B细胞的增殖无显著作用;粘附性实验发现过表达lnc RNA GS1-293C5.1能增加SK-Hep-1、Huh7和SMMC-7721肝癌细胞的自身粘附性,减弱Huh7细胞的异质性粘附性;Transwell侵袭迁移结果显示lnc RNA GS1-293C5.1对SKHep-1、Huh7细胞的侵袭迁移均有抑制作用,而对SMMC-7721的迁移能力有抑制作用,对侵袭作用不明显。(3)lnc RNA GS1-293C5.1和靶基因PON2之间的关系。生物信息学分析提示lnc RNA主要富集在蛋白质修饰、基因表达负调控和细胞粘附等生物过程,涉及RNA转运、RNA降解和m RNA监测等通路;Vienna RNA服务器预测发现PON2 m RNA和lnc RNA GS1-293C5.1两者结合的最小自由能小于两者单独形成二级结构的自由能。QRTPCR检测PON2靶基因在SK-Hep-1、Huh7、SMMC-7721、Hep3B中相对于正常肝癌细胞株HL-7702的相对表达量分别为:0.62、3.19、0.71、1.42,而在过表达肝癌细胞株SK-Hep-1-GS1-293C5.1、Huh7-GS1-293C5.1、SMMC-7721-GS1-293C5.1、Hep3B-GS1-293C5.1中的相对表达为0.37、1.21、0.23、0.73,与正常的肝细胞HL-7702相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Western bolt检测PON2蛋白在SK-Hep-1和SMCC-7721中表达量低,而Huh7和Hep3B的高,与q RT-PCR结果相符。PON2在SK-Hep-1-GS1-293C5.1和SMCC-7721-GS1-293C5.1与野生型SK-Hep-1和SMCC-7721无明显差异。而Huh7-GS1-293C5.1和Hep3B-GS1-293C5.1的PON2蛋白表达均比野生型Huh7和Hep3B低,提示Huh7和Hep3B中GS1-293C5.1和PON2可能存在负调控关系。QRT-PCR显示PON2在肝癌组织中高表达,相对表达量为1.75,肝癌组织中lnc RNA GS1-293C5.1与PON2的表达呈负相关关系(r=-0.31,P=0.03)。结论:本课题研究初步结果表明lnc RNA GS1-293C5.1在肝癌细胞SKHep-1、SMMC-7721中为低表达,在Huh7和Hep3B表达量中等,亚细胞定位主要位于细胞核,预测的靶基因为PON2;肝癌根除术后复发患者肝癌组织中的lnc RNA GS1-293C5.1表达量低于不复发的患者,提示lnc RNA GS1-293C5.1的低表达可能是容易复发的指标;过表达lnc RNA GS1-293C5.1能提高肝癌细胞株的自身粘附能力,减弱Huh7细胞的异质粘附性;过表达lnc RNA GS1-293C5.1抑制肝癌细胞株的侵袭、迁移能力,对细胞增殖、凋亡、细胞周期无影响;过表达lnc RNA GS1-293C5.1后减低了Huh7和Hep3B的PON2 m RNA转录水平和PON2蛋白量,结合生物信息学预测可能是lnc RNA GS1-293C5.1和PON2在二级结构上相关作用所致;而肝癌组织中lnc RNA GS1-293C5.1呈低表达,而靶基因PON2在肝癌组织中是高表达,相关分析提示两者的表达呈负相关关系。