论文部分内容阅读
家蝇(Musca domestica(L.))属双翅目、环裂亚科、蝇科、家蝇属,是一种世界性卫生害虫,能传播多种人畜疾病,严重威胁人类健康。长期以来,人们主要通过化学药剂来防治家蝇,而由于其生长周期短,繁殖力强等特点,导致了家蝇对常用杀虫药剂(有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫药剂)都产生了不同程度的抗性。本文选用家蝇敏感品系和抗残杀威近等位基因系为研究对象,从遗传学、生物化学和分子生物学水平上对其抗性机制进行研究,目的在于揭示在相同的遗传背景下家蝇对残杀威的抗性机制,为制定合理的害虫防治措施,延长残杀威的使用寿命提供理论依据。家蝇敏感PSS品系,田间抗性品系CFD和抗残杀威近等位基因系N-PRR生命表的构建和结果分析显示,抗性品系CFD在幼虫历期、蛹期和雄成虫历期都明显长于敏感PSS品系,且产卵量显著低于敏感PSS品系,相对于敏感品系生物相对适合度为0.85,说明家蝇田间抗性品系存在着适合度代价,即具有适应能力和竞争能力的劣势;抗残杀威的近等位基因系N-PRR在净增殖率R0,平均世代历期T和内禀增长率rm的比较中,与敏感品系没有差异,说明抗残杀威的近等位基因系N-PRR不存在适合度代价。因此,田间抗性品系的适合度代价很可能源自复杂的田间遗传背景,与残杀威的抗性没有相关性。用杂交、回交和自交的方法研究了家蝇对残杀威抗性的遗传方式,证明了家蝇对残杀威的抗性是由常染色体控制的不完全隐形遗传,由一个主效的基因控制,可能存在一个次效因子影响家蝇对残杀威的抗性。交互抗性研究结果显示,家蝇抗残杀威近等位基因系N-PRR对辛硫磷、甲基吡恶磷、联苯菊酯和溴氰菊酯产生了不同程度的交互抗性,其中对有机磷类杀虫剂辛硫磷和甲基吡恶磷的交互抗性分别为57.76和57.54倍,对拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯和联苯菊酯的交互抗性分别为12.06和4.28倍。对高效氯氰菊酯没有产生交互抗性。增效剂试验结果表明,PBO对N-PRR抗性品系和PSS敏感品系分别有>369.48倍和14.70倍的增效作用,DEM对N-PRR抗性品系和PSS敏感品系分别有>213.27倍和0.38倍的增效作用。进一步的生化测定表明,与PSS敏感品系相比,N-PRR抗性品系的谷胱甘肽S-转移酶有显著的增高,而这两个品系的细胞色素P450和羧酸酯酶活性都无显著差异。两个家蝇品系乙酰胆碱酯酶活性比较结果表明,乙酰胆酯酶活性的变化与家蝇对残杀威抗性的产生无关。乙酰胆酯酶动力学研究表明,N-PRR品系的乙酰胆碱酯酶的Km值和Vmax分别为PSS品系的7.52倍和2.16倍,说明N-PRR品系中的乙酰胆碱酯酶对底物的亲和力减小,但对底物的水解能力增强。不同浓度的残杀威对家蝇乙酰胆碱酯酶的抑制作用表明,随着残杀威浓度的不断增加,家蝇乙酰胆碱酯酶的残存活性不断减少,在相同浓度的残杀威抑制作用下,抗残杀威近等位基因系的乙酰胆碱酯酶残存活性百分率大于敏感品系。当雌雄比为6:4时,PSS品系的乙酰胆碱酯酶在残杀威抑制浓度为10-6～3×10-6mol/L时,出现一个平台,表明可能存在两种不同类型的乙酰胆碱酯酶。在残杀威相同浓度的抑制下,家蝇PSS品系和N-PRR品系的乙酰胆碱酯酶的抑制作用主要出现在前15min,在10-15min时抑制作用最大。用SephadexG-25凝胶层析,CEA亲和层析和普鲁卡因亲和层析对家蝇PSS品系和N-PRR品系的乙酰胆碱酯酶进行纯化,普鲁卡因亲和层析柱的纯化效果优于CEA亲和层析柱,其对敏感品系和抗残杀威近等位基因系的纯化倍数分别为140.3和95.5倍,产率分别为5.01%和3.74%。通过5种抑制剂对单底物抑制法,对家蝇敏感品系和抗残杀威近等位基因系的乙酰胆碱酯酶的敏感度测定,结果显示乙酰胆碱酯酶的敏感度与家蝇对残杀威的抗性水平呈负相关,且纯化后家蝇N-PRR品系的乙酰胆碱酯酶的敏感度下降幅度显著提高。结果表明乙酰胆碱酯酶的敏感度降低是家蝇对残杀威产生抗性的原因,而乙酰胆碱醋酶敏感度的下降与其变构有关。利用荧光定量PCR技术研究了 PSS品系雌虫、PSS品系雄虫、N-PRR品系雌虫和N-PRR品系雄虫乙酰胆碱酯酶mRNA表达量差异。PSS品系雄虫、N-PRR品系雌虫、N-PRR品系雄虫的乙酰胆碱酯酶mRNA表达量分别为PSS品系雌虫的2.83,0.85和1.56倍。结果表明家蝇对残杀威抗性的主要机制与乙酰胆碱酯酶基因的量变无关。由转录组测序分析结果可知,家蝇抗残杀威近等位基因系雌虫中具有显著表达差异的基因130个,23个显著富集的GO功能条和3个显著富集的代谢通路,其中与细胞色素P450相关的基因43个;家蝇抗残杀威近等位基因系雌虫中具有显著表达差异的基因409个,60个显著富集的GO功能条和10个显著富集的代谢通路,其中与细胞色素P450相关的基因55个,与谷胱甘肽S-转移酶相关的基因3个。因此,由于乙酰胆碱酯酶的变构导致的敏感度降低是造成家蝇对残杀威产生抗药性的主要机制,谷胱甘肽S-转移酶解毒代谢能力的提高也同其抗性的产生有关。