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目的:探讨凝血因子VIIa(FVIIa)激活结肠癌细胞株SW620细胞表面蛋白酶激活受体2(PAR2),调控凋亡蛋白-半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及黏附分子CD44的表达情况;进一步分析TF-FVIIa-PAR2轴调控这些效应分子表达的信号转导通路,以阐明TF-FVIIa/PAR2促进SW620细胞增殖和迁移的分子机制。
方法:(1)采用FVIIa(10nM)及PAR2激动剂(PAR2-AP,100μM)等处理SW620细胞不同时间,细胞计数法检测细胞增殖能力,wound healing法检测细胞迁移能力,分析FVIIa及PAR2-AP对SW620细胞增殖与迁移的影响。
(2)采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测FVIIa(10nM)、PAR2-AP(100μM)、PAR2拮抗剂(PAR2-aAP,100μM)、抗-TF抗体(a-TF,10μg/ml)、同型对照抗体MOPC-21(10μg/ml)等不同组合刺激SW620细胞后caspase-3的表达变化,分析FVIIa对SW620细胞caspase-3表达的影响以及是否依赖细胞表面的PAR2和TF。
(3)分别采用实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞术(FCM)检测FVIIa(10nM)及PAR2-AP(100μM)刺激SW620细胞MMP-9和CD44分子的表达变化,分析FVIIa及PAR2-AP对SW620细胞MMP-9和CD44分子表达的影响。
(4)进一步利用p38MAPK抑制剂(SB203580,10μM)、ERK1/2抑制剂(U0126,10μM)和NF-κB抑制剂(PDTC,5μM)预处理细胞30min,观察这些抑制剂对FVIIa及PAR2-AP调控细胞caspase-3、MMP-9和CD44表达的影响,从而分析TF-FVIIa/PAR2调控三个分子表达的相关信号通路。
结果:(1)FVIIa(10nM)能够明显促进SW620细胞生长和迁移的能力,与无刺激比较,差异显著(P＜0.05),效果与PAR2-AP(100μM)相似。
(2)FVIIa(10nM)及PAR2-AP(100μM)均能降低细胞caspase-3mRNA和蛋白的表达,增加MMP-9mRNA和蛋白及CD44的表达。
(3)PAR2-aAP(100μM)及a-TF(10μg/ml)均能明显抑制FVIIa对细胞caspase-3表达的下调作用,而同型对照抗体MOPC-21(10μg/ml)无此效应。
(4)U0126(10μM)和PDTC(5μM)能够显著干预FVIIa调节细胞caspase-3、MMP-9和CD44表达的效应;而SB203580(10μM)能够降低FVIIa对MMP-9和CD44表达的刺激效应,对caspase-3表达没有影响。
结论:(1)FVIIa能够促进结肠癌细胞株SW620细胞的增殖和迁移。
(2)FVIIa能够降低SW620细胞caspase-3的表达,增加MMP-9和CD44的表达。
(3)FVIIa下调SW620细胞caspase-3表达依赖于细胞表面的TF和PAR2活化。
(4)信号分子p38MAPK、ERK1/2和NF-κB在TF-FVIIa/PAR2调控细胞caspase-3、MMP-9和CD44表达过程中发挥关键作用。