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烧伤是热、电、化学和放射等造成损伤的总称,是医学界一直关注的焦点之一。严重烧伤并发全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)和多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的死亡率极高。尽管现在医疗水平的提升降低了心衰、肺水肿、消化道应激性溃疡、急性肾功能衰竭等并发症的发病率,但脑损伤的改善并不明显。烧伤后脑损伤往往缺乏客观的诊断指标,易被烧伤本身严重甚至致命的并发症所掩盖。面积大,创面深的烧伤可引发中毒性脑病、脑水肿及惊厥,出现脑损害后遗症。有研究表明:严重烧伤7 h后血脑屏障开放,并持续数天,炎症反应和高糖代谢综合症等进一步对大脑造成损害。目前,关于烧伤后大脑损伤研究较少,临床治疗手段主要以对症支持和控制并发症为主,迫切需要探讨新的治疗方法。干细胞作为一种起源细胞,在一定条件下能修复损伤。近年来,干细胞疗法在神经损伤和神经退行性病变中得到广泛的应用,比如:脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、帕金森病、脑出血、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症等多种疾病。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多能干细胞,易于获得,具有高度的自我复制能力,扩增能力强,免疫原性弱,可以定向分化为多种细胞,在体内移植后可定位在受损的组织内并分泌多种细胞因子修复损伤,已在临床应用方面取得巨大进展。本课题小组以往的研究发现:骨髓间充质干细胞能治疗烧伤后肝脏损伤和肠组织损伤。针对严重烧伤引起机体损伤的广泛性,以及脑损伤的隐匿性,本课题继续通过干细胞移植治疗观察对严重烧伤大鼠大脑损伤的治疗效果,并初步探讨其可能的修复机制。目的:探讨BMSCs静脉移植后对严重烧伤大鼠大脑损伤的修复作用并初步探讨其作用机制。方法:采用全骨髓贴壁培养法,分离、纯化BMSCs,通过流式细胞仪鉴定表面标志CD44、CD45、CD90和细胞周期;并通过诱导所培养的细胞向神经细胞和成骨细胞分化鉴定其为BMSCs。将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、细胞治疗组。将30%体表面积的背部皮肤浸入97±1℃的水中18 s,制备严重烧伤大鼠模型;HE观察烫伤部位皮肤的病理组织学改变。烧伤造模后第1 d和第2 d将CM-Dil标记的BMSCs分两次经眼静脉丛静脉移植到细胞治疗组大鼠体内,每次0.1 m L PBS细胞悬液(含5×106个细胞)。观察各组体重的变化及一般状态。一周后,取大脑组织,HE和尼氏体染色观察各组大鼠大脑组织病理组织学改变;免疫组织化学法检测烧伤大鼠大脑的神经细胞MAP-2、GFAP、NSE蛋白的表达,凋亡相关蛋白Caspase-3,自噬相关蛋白Beclin 1和LC3B在各组脑组织的表达;TUNEL检测神经细胞的凋亡情况;Western Blot检测神经细胞标志NSE和GFAP,凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2、BIM、细胞色素C、Caspase-3,自噬相关蛋白Beclin 1和LC3B在各组脑组织的表达;双免疫荧光检测神经元表面标志与自噬相关蛋白LC3B的共表达。激光共聚焦显微镜检测CM-Dil标记的BMSCs在脑组织中的定位。结果:1.BMSCs的培养及鉴定:第3代培养的细胞呈长梭形,细胞形态较单一。经流式细胞仪检测表明88%细胞停留在G1期,具有强大的增殖潜力;CD44表达率92.86%和CD90表达率95.77%,基本不表达CD45,符合BMSCs的表面标志;经向神经细胞诱导后,免疫细胞化学检测分化细胞表达神经元标志MAP-2,并能在成骨诱导剂的培养下形成钙结节,分化为成骨细胞。2.烧伤大鼠模型的建立:大鼠造模1周内,烫伤处理后皮肤逐渐变硬发黑,第7 d伴有结痂现象,饮食饮水少,精神萎靡;HE观察烫伤6 h后皮肤出现病理改变,表皮和真皮的附件破坏,细胞严重损坏可判定为深Ⅱ度到Ⅲ度的严重烧伤。1周后,大脑海马以及皮层部位细胞有不同程度的水肿,细胞核出现固缩;尼氏体染色观察,大脑海马以及皮层部位神经细胞的尼氏体减少,排列紊乱。免疫组织化学结果表明模型组大鼠大脑组织的神经元标志物MAP-2表达与对照组比较显著减少(P<0.05),神经胶质细胞标志物GFAP显著增多(P<0.05)。3.BMSCs移植对烧伤大鼠的修复作用:大鼠BMSCs移植后1周,模型组大鼠精神萎靡,进食少;而细胞治疗组大鼠较模型组大鼠活泼,进食良好。细胞治疗组大鼠的平均体重较模型组有所增加,并呈缓慢上升趋势。HE病理组织学观察结果表明:BMSCs移植后,与模型组大鼠比较,大脑皮层部位细胞水肿程度减轻,细胞核固缩减少;尼氏体染色观察,细胞治疗组大鼠神经细胞尼氏体增多,排列较整齐。TUNEL法检测,细胞治疗组大鼠大脑凋亡细胞的阳性率显著低于烧伤模型组,均显著高于对照组(P<0.05)。免疫组织化学和Western Blot检测结果显示:与模型组大鼠相比细胞治疗组大鼠NSE、Bcl-2、Bcl-2/Bax表达显著增多(P<0.05),两组均显著低于对照组(P<0.05);细胞治疗组大鼠大脑组织GFAP、p53、Bax、BIM、细胞色素C、Caspase-3表达显著低于模型组(P<0.05),显著高于对照组(P<0.05)。双免疫荧光检测细胞治疗组大鼠大脑神经元(表达NSE)的自噬阳性细胞(表达LC3B)率显著低于模型组(P<0.05),显著高于对照组(P<0.05)。结论:严重烧伤可引起大脑组织的损伤,BMSCs移植对烧伤引起的大脑损伤具有修复作用,具体的机制可能与抗凋亡和减少自噬相关。