目的:　　Ppr1基因(NCBI:DR-0167)是存在于耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans, DR)R1中的大小约970bp的基因,是耐辐射球菌所特有的负责辐射抗性的一个开关基因。它可以显著调节辐射修复基因recA和pprA等基因的表达,并能增强细胞清除自由基的能力。ppr1基因介导的DNA修复和保护作用,是耐辐射球菌在强辐射作用下仍能保持生存和基因组完整性的重要原因之一。ppr1基因转化模式生物大肠杆菌后,不仅可以增强大肠杆菌的辐射抗性,还能提高大肠杆菌的抗逆性及耐盐能力。　　Ppr1基因的抗放作用是通过其功能蛋白实现的。由于pprI是在原核生物耐辐射球菌中所独有的基因,欲研究其蛋白在真核生物中,特别是对哺乳动物及细胞的作用,须获得真核表达系统翻译转录的具有生物活性的蛋白质。将pprI原核基因转入真核生物中稳定高效表达,获得具有生物活性的PprI蛋白,迄今为止在国内外尚未见有关报道。真核表达的PprI蛋白提纯后应用于动物实验,在国内外也是空白。本课题旨在将ppr1基因转化酵母菌,将目的蛋白提纯并应用于受照实验动物,研究PprI蛋白对酵母菌及哺乳动物小鼠的抗放作用于机理。为进一步用于临床辐射损伤防治提供有价值的理论和实验资料。　　材料与方法:　　本课题构建了pprI基因的毕赤酵母表达载体pHBM-PprI,并成功转化进入GS115酵母菌株。应用质谱分析PprI蛋白在酵母菌中的分泌表达。对转化菌株及未转化菌株进行辐射抗性试验,检测酵母菌中抗氧化酶SOD、CAT活性,应用Western检测酵母菌中辐射修复蛋白Rad24和Rad51的表达量,并进行半定量分析。　　为了研究PprI蛋白对哺乳动物及细胞的抗放作用,本课题构建了含有(His)6以及TAT标签的酵母表达载体pPICZαA-PprI质粒,转化酵母菌株获得分泌型表达,通过镍柱层析提纯目的蛋白。　　提纯后的PprI蛋白应用于动物实验。首先观察了肌肉和腹腔注射对受照小鼠辐射后死亡率的影响。该实验不仅观察了两种注射方式,还分组观察了注射时间与辐射时间前后及时间的差异。其次,观察了受照小鼠外周血细胞数量及骨髓细胞增殖能力的变化。接着分别检测了受照小鼠器官、组织中SOD、CAT活性变化,以及Rad17和Rad51的表达。最后,应用人体外周血体外培养,观察PprI蛋白对受照淋巴细胞染色体畸变率的影响。　　结果:　　1.本课题根据毕赤酵母密码子偏好性,重新合成pprI基因,构建了毕赤pHBM-pprI质粒表达载体,并转化毕赤酵母GS115菌株。表达产物经质谱分析,证实耐辐射球菌的PprI蛋白在毕赤酵母GS115菌株成功获得分泌型表达。　　2.DR菌pprI基因在酵母菌中异位表达,提高了酵母菌的辐射抗性,与对照组比较,pprI基因转染在酵母菌克隆形成率显著提高(P<0.05); Rad24和Rad51表达量与SOD、CAT活性增高(P<0.05)。　　3.以本室保存的pCMV-HA-pprI为模板构建的pPICZαA–pprI真核表达载体,转化毕赤酵母X33菌株,经SDS-PAGE和His-tag的抗体做Western blotting鉴定,显示PprI融合蛋白在酵母菌株中成功分泌表达。转化后的菌株发酵上清液,经镍柱层析提纯,获得了浓度为0.34mg/ml的目的蛋白。　　4.在辐射前后1h内,给予小鼠肌肉注射和腹腔注射PprI蛋白可以使小鼠死亡率从对照组的50％降低到20％。PprI蛋白腹腔注射,受照小鼠外周血红细胞、血小板数量增加,淋巴细胞百分比增加,小鼠骨髓细胞克隆形成率较对照组明显著提高(P<0.05)。　　5.PprI蛋白辅助培养对人离体外周血淋巴细胞染色体畸变无显著影响。　　结论:　　1.本课题组成功的地合成了新的耐辐射球菌pprI基因编码序列,首次构建了pPICZαA–pprI真核表达载体,在酵母菌中获得异位高效表达和纯化　　2.转pprI基因酵母菌的辐射抗性显著增加。转基因酵母菌抗氧化能力及辐射修复蛋白表达增加可能是其辐射抗性增加的分子机理之一。　　3.在小鼠受照前后注射PprI蛋白,可提高受照小鼠的抗辐射能力,主要表现为小鼠死亡率明显降低;骨髓细胞克隆形成率提高;小鼠外周血红细胞、血小板计数和血淋巴细胞百分率增加。　　4.PprI蛋白抗放作用机理的研究发现,PprI蛋白可提高受照小鼠红细胞、血浆、骨髓细胞、肝脏中的CAT、SOD活性,但对心肌细胞、肾脏组织中的CAT、SOD活性无明显影响;并且增加受照小鼠肝脏、肾脏、脾脏、心脏组织中Rad17、Rad51蛋白的表达量,使其表达时间延长。　　上述研究成果为PprI蛋白进一步临床应用提供了有价值的理论和实验资料。