论文部分内容阅读
目的:（1）建立D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）诱导的小鼠Sertoli细胞株TM4细胞衰老模型;（2）研究淫羊藿苷（Icariin,ICA）对衰老Sertoli细胞株TM4细胞的改善作用,并从ERα-Nrf2信号通路探讨其分子机制。方法:1、将培养的小鼠Sertoli细胞株TM4细胞给予D-gal刺激,实验分为Control组、D-gal 100 m M组和150 m M组。检测指标如下:（1）MTT筛选D-gal浓度;（2）光镜观察TM4细胞形态变化;（3）β-半乳糖苷酶（β-gal）染色法观察细胞衰老情况;（4）RT-PCR检测衰老相关基因P16和P21 m RNA表达水平;（5）免疫荧光法检测P21表达及定位;（6）流式细胞术检测TM4细胞周期变化及细胞凋亡;（7）RT-PCR及Western blot法检测TM4分泌的相关因子GDNF、BMP4、SCF和PLZF m RNA和蛋白表达水平;（8）Western blot法检测Nrf2信号通路相关蛋白（Nrf2、HO-1和NQO-1）的表达;（9）免疫荧光法检测Nrf2表达及定位。2、将培养的TM4细胞分为Control组、D-gal组、DMSO组和ICA（0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4、8μM）组,通过MTT筛选出ICA药物浓度。随后再将实验分为Control组、D-gal组、D-gal+ICA（0.5μM）组和D-gal+ICA（1μM）组。检测指标如下:（1）β-gal染色法观察ICA对衰老TM4细胞的影响;（2）Western blot法检测TM4细胞分泌因子GDNF、BMP4、SCF和PLZF蛋白表达水平;（3）荧光探针DCFH-DA法检测ICA对衰老TM4细胞中ROS水平的影响;（4）Western blot法检测Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表达水平;（5）免疫荧光法检测Nrf2的表达及定位;（6）Western blot法检测TM4细胞雌激素受体ERα、ERβ的蛋白表达水平。3、将培养的TM4细胞给予ICA（1μM）预保护后,转染ERαsi RNA至TM4细胞中,同时给予D-gal刺激。检测指标如下:（1）免疫荧光法筛选TM4细胞中si RNA瞬时转染浓度;（2）Western blot法筛选ERαsi RNA最佳沉默效率;（3）将TM4细胞分为Negative Control组、D-gal组、D-gal+ICA组和D-gal+ICA+ERαsi RNA组,采用β-gal染色法观察给予ERαsi RNA后,ICA对衰老TM4细胞的影响;（4）Western blot法检测ERα、Nrf2、HO-1、NQO-1、GDNF、BMP4、SCF和PLZF的蛋白表达水平;（5）免疫荧光法检测Nrf2的表达及定位。结果:1、（1）MTT结果显示,与Control组比较,D-gal为100 m M和150 m M浓度时TM4细胞活性显著下降且不低于50%;（2）光镜结果显示,D-gal 100 m M和150 m M组中细胞形态不完整,细胞表面粗糙,胞质出现空泡化,且部分细胞由长梭形逐渐变圆、细胞体积及细胞核显著增大,且D-gal 150 m M组细胞体积增大更明显,伴有细胞数量减少的现象;（3）β-gal染色结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M组和D-gal 150m M组衰老细胞数量均显著增多;（4）RT-PCR结果显示,与Control组比较,D-gal 100m M和150 m M组衰老基因P16、P21 m RNA表达均显著上调;（5）免疫荧光结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M和150 m M组TM4细胞核内P21荧光表达明显增加,表明衰老细胞数量增多;（6）凋亡结果显示,D-gal 100 m M组细胞早期凋亡比率与Control组无明显差异,而D-gal 150 m M组细胞早期凋亡比率较前两者有所增加,表明D-gal 100 m M组成功诱导TM4细胞衰老;（7）周期结果显示,与Control组比较,D-gal100 m M和150 m M组处于G1期的细胞比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1期,表明D-gal刺激影响了TM4细胞的分裂和增殖;（8）RT-PCR及Western blot结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M和150 m M组中TM4细胞分泌的细胞因子GNDF、SCF、BMP4和PLZF m RNA及蛋白表达水平均显著降低;（9）Western blot结果显示,D-gal 100 m M和150 m M组Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表达水平显著下调;（10）免疫荧光结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M和150 m M组细胞中Nrf2的荧光表达减弱。2、（1）MTT结果显示,0.5μM和1μM的ICA能够提高衰老TM4细胞活性;（2）β-gal染色结果显示,ICA能够减少衰老TM4细胞β-gal染色阳性表达,改善细胞衰老;（3）Western blot结果显示,ICA能够上调衰老TM4细胞分泌因子GDNF、BMP4、SCF和PLZF蛋白表达水平,改善衰老TM4细胞的功能;（4）荧光探针DCFH-DA结果显示,ICA能够降低衰老TM4细胞ROS水平;（5）Western blot结果显示,ICA能够上调Nrf2、HO-1和NQO-1的表达,提高TM4衰老细胞的抗氧化能力;（6）免疫荧光结果显示,ICA能够增加TM4细胞核内的Nrf2荧光表达,激活Nrf2信号通路;（7）Western blot结果显示,ICA能够上调衰老TM4细胞ERα、ERβ的蛋白表达水平。3、（1）免疫荧光结果显示,si RNA浓度为100 n M时TM4细胞瞬时转染效果最佳;（2）Western blot结果显示,与Negative Control组比较,ERαsi RNA-1735组蛋白表达抑制效果最显著;（3）β-gal染色结果显示,与D-gal+ICA组比较,给予ERαsi RNA干扰后细胞内β-gal表达明显增多,表明衰老细胞数量增加;（4）Western blot及免疫荧光结果显示,与D-gal+ICA组比较,D-gal+ICA+ERαsi RNA组中ERα、Nrf2、HO-1、NQO-1、GDNF、BMP4、PLZF蛋白表达均下降,且细胞的Nrf2荧光表达也减少。结论:1、D-gal能诱导体外培养的小鼠Sertoli细胞株TM4细胞衰老,其机制可能与下调Nrf2信号通路有关。2、ICA能够改善Sertoli细胞株TM4细胞衰老,并改善其功能,其机制与调节ERα-Nrf2信号通路有关。