乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切。目前抗HBV的药物主要为干扰素类药物及核苷酸类似物,虽能取得一定疗效,但由于其治愈率仍旧较低,以及各种副作用(如骨髓抑制、神经精神症状加重等)和耐药性的产生,使得大多数患者需要接受无限期的治疗。因此,进一步研究HBV感染与人体相互作用机制,寻找新的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。乙型肝炎病毒是一种具有包膜的嗜肝性病毒,是最小的通过逆转录进行复制的部分双链环状DNA病毒,基因组长度约3.2kb。在HBV病毒感染细胞过程中,其疏松的环状DNA(rc DNA)进入细胞核修复成高度稳定的共价闭合环状DNA(ccc DNA),之后以ccc DNA为模板转录出各种HBV病毒的RNA,包括前基因组RNA(pg RNA)。HBV的包膜蛋白包括大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)、小蛋白(SHBs)三种形式,在HBV的生活周期中起到重要的作用。病毒与宿主间复杂的相互作用关系,提示我们深入地研究病毒与宿主之间相互作用机制,通过机制揭示,可以为开发针对HBV的创新型药物提供更多的新的药物作用靶点。在对人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的研究中,人们发现了人体内一系列能够拮抗HIV的宿主蛋白,称为宿主限制性因子。作为科学家们竞相研究的前沿热点科学问题,宿主限制性因子主要包括APOBEC3家族,TRIM5α,BST-2,SAMHD1,Mx2,GBP5等。宿主限制性因子能够干扰包括病毒脱衣壳、核酸进入、基因组复制、病毒粒子释放及融合等在内的病毒复制各个阶段,并且其抗病毒能力往往具有广谱性。2015年,科学家发现了一种新的限制性因子—丝氨酸整合因子5(serine incorporator 5,SERINC5)对HIV病毒感染的抑制作用。证明了HIV辅助蛋白Nef缺失的情况下,分布在细胞膜上的SERINC5会在HIV子代病毒释放过程中整合入病毒粒子包膜,使其在进入下一个靶细胞时受阻,从而降低HIV的感染性,抑制HIV病毒的复制。而Nef则通过将SERINC5限制在核周的囊泡阻止其包装入子代病毒包膜,帮助病毒逃避SERINC5的限制。鉴于宿主限制性因子抗病毒的广谱性,结合SERINC5是通过影响HIV包膜蛋白的组成结构从而降低HIV感染性的机制,那么SERINC5对其它具有包膜的病毒粒子是否具有类似影响?本研究将SERINC5应用于同样具有包膜的HBV,探讨SERINC5对HBV复制的调控作用,得出了以下实验结果及结论:1.SERINC5能够抑制HBV的分泌;本研究在Hep G2细胞中转染HBV感染性克隆质粒,同时呈剂量梯度分别共转SERINC5、SERINC3和SERINC1质粒,用ELISA方法检测上清中HBV表面抗原(HBs Ag)的含量。与对照组相比,SERINC5组细胞上清中HBV HBs Ag明显减少,而SERINC3组及SERINC1组无此现象。同时,本研究用免疫共沉淀的方法提纯上清中HBV完整病毒粒子,并使用实时定量PCR检测病毒粒子DNA水平,发现SERINC5组上清中HBV完整病毒粒子明显减少。那么,SERINC5是在HBV复制的哪一个阶段发挥了抑制作用呢?本研究使用Southern blot及Northern blot技术分别检测发现细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA的含量均未受到影响。这说明,SERINC5抑制了HBV完整病毒粒子及表面抗原的分泌。本研究同时使用RNA干扰技术,在Hep G2细胞中下调SERINC5的表达,发现上清中HBs Ag及HBV完整病毒粒子的含量均有所增加,而细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA含量均无变化。在Hep G2.2.15细胞中过表达SERINC5,得到与Hep G2细胞中相同的结果。本研究同时建立了感染体系,在Hep G2-NTCP细胞中过表达SERINC5,并用Hep AD38产生的HBV病毒进行感染,同样得到SERINC5抑制HBs Ag及HBV完整病毒粒子分泌的结果。以上结果说明,SERINC5能够抑制HBV的分泌。2.SERINC5影响HBV包膜蛋白包括大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)、小蛋白(SHBs)的糖基化修饰;为了探究SERINC5抑制HBV分泌的机制,本研究考察了SERINC5对HBV各种功能蛋白的影响。发现SERINC5能够影响HBV包膜蛋白包括LHBs、MHBs、SHBs的糖基化修饰,使其糖基化形式减少,而非糖基化形式增加。3.SERINC5通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,达到抑制HBV病毒粒子分泌的作用本研究设计了HBV包膜蛋白糖基化位点突变体,发现SERINC5对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似,同时也与衣霉素对LHBs,MHBs和SHBs糖基化的抑制作用相似。根据前人研究已经指出的包膜蛋白去糖基化严重损害HBV病毒粒子的分泌,本研究又使用p HBV1.3-ENV-质粒,野生型LHBs质粒及LHBs N146A糖基位点突变质粒,设计病毒合成包装分泌实验,考察SERINC5对HBV分泌的影响。确定SERINC5是通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌这一观点。4.SERINC5与LHBs共定位在细胞的高尔基体;蛋白质糖基化修饰过程中,翻译后的蛋白质首先在内质网腔内或内质网膜被连接上糖链,随后被运送到高尔基体中,经过一系列糖基转移酶及糖苷酶继续添加糖链并对合成的糖链进行剪切等进一步修饰,最后成为成熟的糖蛋白。为了进一步探究SERINC5影响HBV包膜蛋白糖基化修饰的机制,本研究选用了免疫荧光共定位技术,分析SERINC5与LHBs在Hep G2细胞中的亚细胞定位。发现当LHBs单独存在时,其在细胞质中均匀分布,但在SERINC5存在的情况下,LHBs则与SERINC5完全定位在高尔基体中而不是内质网。并且免疫共沉淀技术证实SERINC5能够分别与LHBs、MHBs、SHBs结合。因此,本研究分析认为SERINC5影响了HBV包膜蛋白在细胞中的定位,从而影响其糖基化修饰。5.对SERINC5抑制HBV功能区进行鉴定。SERINC5属于膜蛋白,据推测具有10个跨膜螺旋结构。本研究设计了不同的SERINC5截短体、磷酸化突变体及糖基化突变体,目的是鉴定SERINC5抑制HBV分泌的功能区。实验发现SERINC5的第四至第六穿膜结构域对于其抑制HBV的功能是不可或缺的。对预测的SERINC5两处磷酸化位点S34、T333分别进行突变后,其抑制HBV的功能有轻度的减低。但由于SERINC5分别缺失34和333的两个截短体(145-461和1-311)仍保留完整的抗HBV活性,说明这两个点突变并不是通过影响磷酸化修饰来影响SERINC5抗HBV活性。另外两个SERINC5保守的糖基化位点N133和N294与其对HBV的抑制作用无关。综上所述,本研究运用病毒学、分子生物学及细胞生物学手段,证明了SERINC5对HBV分泌的抑制作用,并揭示了SERINC5通过与HBV包膜蛋白结合,改变其亚细胞定位,使其重新分布在高尔基体,从而影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,抑制HBV病毒分泌的这一机制。SERINC5是一种潜在的抗HBV内在因子,对SERINC5的深入研究可能为我们提供一条抗HBV的新途径,并对研究其他病毒起到启示作用。