论文部分内容阅读
3,4-二氢嘧啶-2（1H）-酮（3,4-dihydropyrimidine-2（1H）-ones,DHPMs）类化合物具有广泛的生物学效应,包括抗病毒,抗肿瘤,抗炎,抗糖尿病,抗菌,钙通道拮抗剂抗高血压和清除自由基等。近年来DHPMs引起了越来越多的人注意,通过简便温和的手段获得高收率和高立体选择性DHPMs尤为重要。Biginelli反应是常见的多组分反应之一,是1893年由意大利化学家Pietro Biginelli利用苯甲醛、尿素和乙酰乙酸乙酯通过―一锅煮‖法进行的环化缩合反应生成DHPMs,由于其反应条件温和、操作简单,是合成DHPMs的重要方法。二氢嘧啶类化合物在众多的报道中多数为热休克蛋白70（Heat shock protein 70,Hsp70）抑制剂,但Christopher报道了二氢嘧啶类化合物SW02对Hsp70没有抑制作用,反而有中等强度的激动作用。本论文以化合物SW02为先导化合物进行结构优化和构效关系研究,以期发现DHPMs作为Hsp70抑制剂与激动剂在结构上的差异。首先通过Biginelli反应得到一系列二氢嘧啶类化合物母环,再进行N1位烷基化取代反应。我们采用正交设计L8（27）以研究N1-烷基化选择性和产率的影响因素。根据优化后的实验条件设计合成了22个二氢嘧啶类化合物,并完成理化性质及活性评价。目标化合物由1H NMR、13C NMR、HR-MS进行结构确证。在抗肿瘤活性测试中,使用C57小鼠建立同种移植肿瘤模型,观察目标化合物对肿瘤的抑制作用。根据体内动物实验结果,选择具有良好抗癌活性的13种取代DHPMs,使用Sybyl-X2.0产生药效团并指导新型DHPMs抗肿瘤衍生物的设计。在抗AD活性测试中,用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞诱导分化为成熟神经元细胞,并用冈田酸模拟AD神经元受损模型,以SW02为对照,采用MTT法,显微镜直接观察以及突触长度的变化对目标化合物进行活性筛选,用Western blot分析蛋白表达情况,并用流式细胞仪分析目标化合物对细胞总活性氧的影响。同种移植肿瘤模型中的实验结果表明,化合物303和305能够显著抑制肿瘤生长,对Hsp70可能是抑制作用。在100 mg/kg下,抑制率（IR）分别为54.9%和34.3%。R1中的4-联苯基低弱供电子基,R3中的对溴苄基和烷基链对同种移植肿瘤模型具有中等生长抑制作用,化合物303和305可作为进一步优化的先导化合物。在药效团中共生成15个药效团模型,模型1是其中最好的一个,有3个疏水团,3个氢键受体和2个氢键供体。其中两个受体原子位于R2位置和羰基氧的位置,疏水中心是DHPMs的母环,R1位和R2位。在抗AD活性测试中,R3位为含氧烷基链的化合物102、201、301、401、501、601、801均没有明显的细胞毒性,并且在体外AD神经元受损模型中均具有不同程度促进突触生长的作用,因此该类化合物可能是Hsp70的激动剂,为后续开展化合物对Hsp70的ATP酶的结合能力实验提供了思路。通过Giemsa染色法和测量细胞突触长度与胞体长度的比值最终选择了7个可以基本维持细胞形态的DHPMs化合物,Western blot蛋白表达结果可以看出DHPMs化合物102、601对Tau蛋白过度磷酸化具有明显改善作用,并且降低了Hsp70蛋白的表达。DCFH-DA荧光探针检测细胞总活性氧的结果可以明显看出在相同的时间内加入DHPMs化合物可以在一定程度上降低胞内活性氧水平,其中102对细胞总活性氧的改善最明显。DHPMs化合物对神经细胞的保护作用可能是通过抑制细胞内总活性氧水平来降低氧化应激作用,从而延缓突触萎缩,但对于其深层机制有待于进一步的研究。从抗肿瘤和抗AD活性评价结果看,所合成的化合物可能一部分为Hsp70的抑制剂,如化合物303和305,此类化合物的特征是R1为联苯基,R3为对溴苄基或长烷基侧链;一部分为Hsp70的激动剂,如化合物102和601,此类化合物的特征是R1为对溴苯基和对吡啶苯基,R3为含氧烷基链。根据上述实验结果可以继续进行与Hsp70的ATP酶的结合实验和结构优化以得到更好的活性结果。