【摘 要】
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目前,常用的细胞破壁技术有机械破法、超声波法、热解法、化学法以及生物法等;这些方法相比较,生物法具有能量消耗低,反应温和等优势。大肠杆菌是一重要的表达外源蛋白的基因工程菌,已经发现一些生物自身蛋白可以造成大肠杆菌细胞破裂。这些蛋白中溶菌酶可以通过作用N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸促使使细胞破裂;噬菌体裂解蛋白可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖造成细胞破裂;动物细胞焦亡相关蛋白片N端片段也可以通过作用细
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目前,常用的细胞破壁技术有机械破法、超声波法、热解法、化学法以及生物法等;这些方法相比较,生物法具有能量消耗低,反应温和等优势。大肠杆菌是一重要的表达外源蛋白的基因工程菌,已经发现一些生物自身蛋白可以造成大肠杆菌细胞破裂。这些蛋白中溶菌酶可以通过作用N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸促使使细胞破裂;噬菌体裂解蛋白可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖造成细胞破裂;动物细胞焦亡相关蛋白片N端片段也可以通过作用细菌细胞壁外膜上的脂多糖成分从而裂解细胞。本论文就是通过把这三类不同蛋白融合在一起造成大肠杆菌自裂解。通过构建pUC-57Y、pACYC-184YG中间载体,成功的将合成的启动子序列、编码bacteriophage sp.isolate 181序列、RBS核糖体结合位点、gasdermin D-N端序列和终止子连接在一起,构成重组融合基因片段。然后将其成功打靶到大肠杆菌BL-21基因组中。将构建的含有重组基因片段的重组大肠杆菌BL-21与原始大肠杆菌BL-21、某制药公司含裂解蛋白的BL-21菌株的生长速率、裂解效率进行测定,最终获得可调控自裂解大肠杆菌菌株。结果如下:（1）本研究得到的大肠杆菌生长性能方面优于某制药公司提供的含裂解蛋白的BL-21菌株,生长速率快大约10%左右;（2）将构建的菌株由IPTG溶液诱导,诱导其发生裂解,测得自裂解效率约为86.77%,相比较某制药公司的裂解菌株裂解率为76.36%,表明本研究所结合的裂解蛋白发挥作用效果良好。综上所述,本研究成功的构建了可调控的自裂解大肠杆菌菌株,该菌株自身不含质粒,可以方便表达外源蛋白,细胞自裂解可以避免大肠杆菌破碎时造成产物失活现象,节省破壁所需要的物力财力,为药物蛋白生产提供更优良的宿主。
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