论文部分内容阅读
研究背景和目的: HBV感染与肝癌的发生和发展密切相关,HBVX蛋白(HBx)具有促进肝癌细胞生长、转移等恶性表型的生物学功能,被认为是重要的促癌因子;在临床 HBV相关肝癌组织中羧基端截短型的HBx普遍存在。去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)通过调节细胞内蛋白质的稳定性和功能活性,影响细胞增殖、分化、凋亡等诸多生物学过程,维持细胞稳态。去泛素化酶的功能异常与肿瘤等多种疾病的发生、发展相关。我们通过筛选发现,羧基端截短突变型的HBx蛋白可负调控去泛素化酶USP16表达。本研究旨在探讨USP16对肝癌细胞体内、外的生物学效应和分子机制,揭示在HBV相关的HCC发生中USP16表达下调事件的生物学意义。 实验方法: 在永生化肝细胞LO2和肝肿瘤细胞HepG2中,过表达羧基端截短型HBx蛋白HBx△35和HBx△14,利用Real-time PCR方法检测40个去泛素化酶蛋白mRNA表达的变化;比较检测26例含羧基端截短型HBx的临床肝癌组织和配对的、含全长HBx的癌旁样本中的USP16的表达丰度。利用慢病毒载体分别构建稳定过表达USP16和敲低USP16的肝肿瘤细胞系;通过MTT,克隆形成,流式细胞术,体内荷瘤等方法,检测USP16表达对细胞生长、细胞周期变化、细胞失巢凋亡、体内成瘤能力的影响,同时观察USP16对肝肿瘤细胞干性特征和化疗耐药敏感性的调控;通过全基因组表达谱芯片和软件分析受USP16影响的下游相关通路,并进行验证;同时,利用免疫组化分析USP16蛋白表达水平与临床HCC的病理参数的关联。 实验结果: 在LO2,HepG2,Huh7和PLC/PRF/5细胞中,过表达羧基端截短型HBx蛋白导致USP16表达下调。NF-κB抑制剂可拮抗羧基端截短型HBx对USP16表达的抑制作用。含羧基端截短型HBx的肝癌组织较含全长HBx的癌旁样本相比,USP16 mRNA表达丰度显著降低。敲低USP16的表达促进Huh7和PLC/PRF/5细胞生长、减少细胞的失巢凋亡;体内实验表明,敲低USP16的表达显著提高Huh7细胞的成瘤能力。过表达USP16能够拮抗截短型HBx△35促Huh7和 PLC/PRF/5肝肿瘤细胞生长效应,包括细胞增殖、失巢凋亡水平以及Huh7细胞体内成瘤能力。敲低的USP16表达能够显著提高Huh7和PLC/PRF/5细胞的sphere形成能力和干性相关基因Sox2,Nanog,CD44,CD133的mRNA表达水平;同时,抑制USP16表达可降低Huh7和PLC/PRF/5细胞对5-Fu和阿霉素的敏感性;在HBx△35过表达的细胞中,外源USP16的表达在一定程度上可提高细胞对化疗药物的敏感性,并能拮抗HBx△35对 Huh7和PLC/PRF/5细胞的干细胞性特征的促进作用。全基因组表达谱芯片结果显示,USP16敲降能够导致多个PTEN信号相关基因表达的改变,包括GSK3β,KRAS,FLT4,ITGA2,BCL2等;同时我们发现,USP16敲降可抑制细胞中PTEN蛋白的表达。在100例临床肝癌组织样本中,相对于癌旁肝细胞,癌细胞中的USP16蛋白水平显著降低,另外,USP16水平还与肿瘤的T分期和病理分级负相关。 结论: 去泛素化酶USP16的表达被羧基端截短型HBx抑制;USP16的表达可抑制肝肿瘤细胞的成瘤能力并影响细胞对化疗药物的敏感性和干性表型特征;USP16能够拮抗羧基端截短型HBx的促肿瘤效应。USP16表达可影响肝肿瘤细胞PTEN等信号通路。在临床肝癌组织中,肿瘤细胞中的USP16蛋白的表达水平低于其在癌旁肝细胞中的水平,USP16表达与肿瘤的T分期和病理分级呈负相关。因此,我们认为羧基端截短型HBx蛋白介导的USP16表达下调事件可能参与肝癌发生、发展。