论文部分内容阅读
肌纤维数量与猪的产肉潜力及生长速度密切相关，骨骼肌卫星细胞的分裂与增殖程度决定了骨骼肌纤维生长总量的变化。Notch信号通路是调控胚胎形成期及成年阶段肌卫星细胞激活和增殖的主要途径，但是Notch信号通路影响猪骨骼肌卫星细胞的增殖的调控机理尚无报道，因此，通过研究Notch信号通路作用于猪肌卫星细胞的分子调控机理，及其在中外不同猪种蓝塘猪和长白猪不同发育阶段肌肉组织中Notch信号通路相关基因表达量的规律，为解析猪肌肉组织的生长和发育提供分子理论依据。 本研究以1日龄长白仔猪骨骼肌卫星细胞为主要研究对象，建立了的猪骨骼肌卫星细胞分离、纯化、鉴定和培养体系；确定了猪骨骼肌卫星细胞中Notch信号通路，Notch信号通路对猪骨骼肌卫星细胞发育的影响及其分子调控机理；分析了蓝塘猪和长白猪不同发育时期肌肉组织中Notch信号通路相关基因表达规律；并检测了力生长因子(Mechano Growth Factor，MGF)对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，主要结果如下： 1、采用Ⅱ型胶原酶消化和两次差速贴壁纯化的方法获得了高纯度的猪骨骼肌卫星细胞，在P0和P3代细胞中，纯度分别达到了97％和96％。比较P0和P7代猪骨骼肌卫星细胞的周期分布情况、细胞转染能力和分化能力，发现P0和P7代细胞之间细胞周期分布情况和转染效率并无显著差异；P0代细胞在诱导第7天时，出现肌管，而在P7代细胞中，诱导第3天就出现了肌管。 2、为了明确猪骨骼肌卫星细胞中Notch信号通路调控通路模式，本研究首先检测了Notch1-4同源受体在猪骨骼肌卫星细胞中的表达情况，Notch1-3在细胞中有表达，Notch4不表达。经过siRNA阻断Notch1-3，发现下调Notch1表达，会降低靶基因Hes5的表达，抑制细胞进入细胞周期，而下调Notch2和Notch3则无显著影响，说明猪骨骼肌卫星细胞中，Notch1为Notch信号通路发挥作用的主效受体，其靶基因为Hes5。激活Notch1-Hes5途径，会下调MyoD和Myogenin的表达、上调细胞周期蛋白CCNB1、CCND1、CCND2、CCNE1表达量、下调细胞周期负调控蛋白P21表达量，从而促进细胞进入细胞周期，促进细胞增殖。阻断Notch1介导的信号通路，会显著下调Hes5的表达量、显著上调肌肉调控因子MyoD和Myogenin的表达、上调细胞周期负调控蛋白P21、下调细胞周期蛋白CCNB1和CCND1的表达，从而阻滞猪骨骼肌卫星进入细胞周期，抑制细胞分裂，从而抑制细胞增殖。 3、本研究探讨了Notch信号通路与GSK3β之间的相互作用关系。干扰Notch124和48h时，发现GSK3β3的表达量降低，差异显著，激活Notch124和48h时，GSK3β3的表达量升高，但是另4个亚型(GSK3β1，GSK3β2，GSK3β4，GSK3β5)的表达量并没有明显的变化，结果表明Notch1能够正调控GSK3β-3的表达。进一步过表达GSK3β-3，检测到Notch1极显著上调，Hes5显著上调，MyoD基因的表达量显著下调，表明外源高表达GSK3β-3能显著上调Notch1受体的表达，通过靶基因Hes5调控MRFs的表达。因而在猪骨骼肌卫星细胞中，Notch1和GSK3β-3之间以环路模式相互调控。 4、为了探讨中外猪种肌肉发育调控机制的差异，在蓝塘猪和长白猪胚胎期49天(E49)，77天(E77)，91天(E91)和出生后2天(B2)检测Notch信号通路相关基因的表达差异。E49和E77时期，Notch1及其靶基因Hes5在蓝塘猪中的表达量均极显著高于长白猪，E91时期，Notch1及其靶基因Hes5在长白猪中的表达量均极显著高于蓝塘猪，说明Notch1和Hes5的变化规律一致。E49和E77时期，MyoD基因在长白猪中的表达量显著高于蓝塘猪，E91时期，MyoD基因在蓝塘猪中的表达量极显著高于长白猪；E49和B2时期，Myogenin基因在长白猪中的表达量高于蓝塘猪，E77和E91时期，Myogenin基因在蓝塘猪中表达量高于长白猪。说明E49和E77时期，可能是蓝塘猪肌肉组织发育受到Notch信号通路调控的重要时期，而E91则可能是Notch通路调控长白猪的主要时期。 5、本研究还发现猪骨骼肌卫星细胞对MGF有剂量依赖效应，当添加浓度达到6ng/ml时，会诱导细胞凋亡。添加MGF后细胞倍增时间为6.81±0.33h，而对照组中倍增时间为9.69±1.02h，两者差异显著，说明添加MGF能显著的促进细胞分裂。此外，分子生物学检测表明添加MGF上调细胞周期蛋白CCNB1的表达，下调细胞周期蛋白抑制因子P21的表达；添加MGF能显著抑制Myosin的表达，从而抑制肌管的形成，抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化。