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二十世纪五十年代以来，器官移植的进展使同种异体器官移植成为治疗多种器官终末期疾病的有效手段。尽管目前免疫抑制方案非常有效，但免疫耐受仍是移植免疫学家和外科医生关注的课题。有多个机制使免疫系统对自身抗原保持耐受，如：克隆清除、忽略、失能、免疫调节。利用这些机制发展出的一些免疫治疗方法在抑制同种异体排斥反应中已经获得了令人鼓舞的结果。调节性T细胞介导的免疫调节是自身耐受的重要机制之一。近年来，调节性T细胞在自身耐受和抑制同种异体排斥反应中的作用受到越来越多的重视。其中，CD4+CD25+T细胞是具有代表性的调节性T细胞。在未经处理的机体内，CD4+CD25+T细胞对保持自身耐受起着关键的作用。在同种异体移植物长期存活的受体内，CD4+CD25+T细胞对抑制同种异体移植物排斥反应也起到很重要的作用。已经证实在移植物长期存活的受体内，可以分出具有免疫调节功能的CD4+CD25+T细胞，这种细胞在体内和体外实验中可以抑制T细胞介导的移植物排斥反应。CD4+CD25+调节性T细胞对同种异体反应性CD4+／CD8+T细胞各有何作用?这种免疫抑制是否是抗原特异性的?本研究主要着眼于CD4+CD25+T细胞对同种异体反应性CD8+T细胞介导排斥反应的作 重庆医科大学博士学位论文用。目的: 本研究的基本目的是制造抗CO40L(COI 54)单克隆抗体，利用它阻断CO40一CO4OL途径诱导同种异体移植物长期存活。从移植物长期存活的受体内分选出CD4+CD25+T细胞，与TCR转基因CDS+T细胞同时过继输注到免疫缺陷小鼠体内，观察CO4+CO25+T细胞对同种异体反应性COS+T细胞介导排斥反应的作用，探讨在阻断CD40se一~CD40L共刺激途径延长移植物存活中，CD4+CD25+调节性丁细胞是否是抑制排斥反应的机制之一。方法1中空纤维培养系统在体外培养抗CO4OL(COI 54)杂交瘤MRI克 隆，收获上清液。硫酸钱半饱和沉淀，OEAE阴离子交换层析分离 纯化抗CO40L单克隆抗体MRI。PBS透析后，505一队GE检测 纯化抗体的纯度，EUSA测定抗体浓度。2将分离纯化的MRI用于体内抑制排斥反应实验。如下:(1)受体 e日A小鼠归Zk)，供体C57B口10小鼠归Zb)，雌雄不拘，分为生理 盐水对照组(n=6)和MRI组(n二31)，行腹腔异位心脏移植。分别 于移植后O，2，4天予生理盐水或500 p 9 MR，腹腔注射。术后每 天触诊移植心脏搏动，以移植心脏停止搏动为移植物排斥时间。在 不同时间点收获移植物作组织学和免疫组化检测。(2)受体CBA 重庆医科大学博士学位论文 小鼠，供体C57B日10小鼠，雌雄不拘，分为生理盐水对照组(n=5)， MRI组(n=5)，MRI+供者特异性淋巴细胞输注组(donor sPeeifie transfusion，DSTn=5)，行尾部全层皮肤移植。MRI给药方案同 前。05丁在移植当天予1 x IO7C57B以10脾细胞静脉注射。移植后 监测皮肤移植物的存活。术后10天做组织学检查。3从移植物长期存活的CBA小鼠体内收获脾脏和肠系膜淋巴结，以 MACS双重分选富集CD4+CD25+T细胞，FACS检测CD4+CD25+ 下细胞纯度。4将CD4+CD25+T细胞(以下称Treg)用于随后抑制TCR转基因 C08+下细胞(特异性识别日2与介导排斥反应的实验，如下:受体为 免疫缺陷的CBA RAG一/小鼠，细胞供体为BM3 RAG小鼠，皮肤供 体C57B以10小鼠，雌雄不拘，分为对照组(n=4)，BM3 CDS组 (n=s)，BM3 CDs+Treg组(n=6)，皮肤移植前1天，对照组不处 理，BM3 CDS组小鼠予1 x 1 05BM3 RAG TCR转基因CDS+T细 胞静脉注射(过继输注)，BM3 CDS+Treg组小鼠予1 X 1 o5BM3 RAG TCR转基因CDS+T细胞联合5 x 1 05CD4+CD25+T细胞 (Treg)静脉注射。1天后，行皮肤移植。术后监测移植物存活情 况。结果1.分离纯化浓缩后的MRI浓度为911 pg/ml。从1300ml培养上清液 重庆医科大学博士学位论文 中分离纯化出385mg MRI。分离所得的MRI与标准品相比有较好 的一致性。2.心脏移植—生理盐水对照组CBA小鼠全部排斥了MHC完全不匹 配心脏移植物，平均存活时间为7.8天，而MRI组心脏移植物平 均存活时间为:129.4天，二者有显著性差异(P<0.01)。尽管移植 物长期存活，组织学和免疫组化结果提示在移植物内有较多的淋巴 细胞浸润。移植物内血管壁增厚。3.皮肤移植—生理盐水对照组皮肤移植物平均存活时间为11.4天， 而MRI组和MR，+OST组皮肤移植物平均存活时间为1 1 .2天， 与生理盐对照组相比无显著性差异(P>0.05)。HE染色提示排斥前， 皮肤增厚，附属物破坏，淋巴细胞浸润。4.对照组CBA RAG一小鼠全部接受C57B口10皮肤移植物，平均存 活时间>100天;BM3 CDS组过继输注1 x105BM3 RAG TCR转 基因COS+T细胞后，皮肤移植物全部被排斥，平均存活时间为24.5 天;SXlo5CD4+Co25+T细胞(Treg)与IXlo5BMs队GTCR 转基因COS+T细胞同时输注，6个受体中有5个存活时间>1 00 天，平均存活时间>100天。BM3 CDS+朴eg组与BM3 CDS组相 比，?