正己烷(n-hexane)是一种工业上常用的有机溶剂,长期接触会诱发暴露人群职业中毒,患者表现出肢体远端的感觉异常、麻木无力,甚至出现下肢瘫痪。自上世纪90年代以来,我国正己烷的生产量和使用量逐年升高,正己烷中毒曾一度成为我国发病率最高的职业病之一。近年来虽然使用了新型溶剂替代正己烷,但长三角、珠三角地区依旧有正己烷中毒的病例报道。目前临床上对正己烷中毒病人无特异性疗法,以营养支持治疗为主,患者痊愈所需时间较长。由于其致病机制尚未明确并且无特效药物治疗,设立生物暴露限值、探究正己烷诱发周围神经病变的机制对职业中毒预防和临床治疗有重要意义。正己烷进入机体后,随着血液循环进入肝脏,主要在肝脏内细胞色素氧化酶CYP2E1的催化下代谢形成γ-二酮类化合物:2,5-己二酮(2,5-hexanedione,2,5-HD)。随后2,5-HD能与体内的含有氨基(-NH2)的基团发生反应形成2,5-二甲基吡咯加合物(简称吡咯加合物),并在体内多种脏器内蓄积。有研究证明吡咯加合物的蓄积、氧化交联反应与周围神经损伤密切相关。提示吡咯加合物可能不仅是机体正己烷中毒的暴露标志物,还有作为效应标志物的潜力,但目前国内外关于吡咯加合物与神经损伤分子机制的有关报道较少,致病机制尚未明确。我国职业卫生标准中设立了车间空气中正己烷最高容许浓度和尿液中正己烷的代谢物——2,5-HD的生物暴露限值。但2,5-HD清除速率较快,脱离暴露1-2天就恢复到正常水平,亦不能反映机体神经损伤情况。临床诊断中使用的血清中神经损伤指标、电生理检查等非特异性指标在中毒的早期无明显变化,因此需要寻找能反映机体神经损伤情况且能进行长期监测的特异生物标志物。前期我们研究发现正己烷染毒的大鼠血清、尿液中吡咯加合物与神经损伤有较好相关性。本次研究使用大鼠为实验模型,建立毛发吡咯加合物测定方法,监测长期正己烷暴露大鼠毛发中吡咯加合物与行为学改变,比较血清、尿液和毛发吡咯加合物与神经损伤的相关性,计算毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平(No-observe-adverse-effect-level,NOAEL),探究其作为生物暴露限值预防正己烷中毒的可行性。为了确定吡咯加合物蓄积与正己烷中毒的因果关系,我们使用CYP2E1抑制剂二烯丙基一硫减少大鼠体内正己烷的代谢活化,探究神经组织吡咯加合物蓄积与神经损伤的关系,验证NOAEL值的可行性。同时探讨正己烷诱发周围神经病变的早期事件、关键调控分子和损伤机制,发现有效的干预和治疗靶点,为正己烷暴露人群的职业中毒预防和临床治疗提供实验依据。第一章毛发吡咯加合物作为正己烷诱发周围神经病变的生物标志物研究目的正己烷诱发周围神经病变的发病过程是一个慢性过程。前期研究血清、尿液样本中吡咯加合物浓度与染毒动物神经损伤呈较好的相关性,尽管血清、尿液中吡咯加合物半衰期比2,5-HD长,但并不适用于正己烷中毒的职业中毒预防和临床诊断。毛发样本具有较好的稳定性,能反映吡咯加合物在机体内长时间的蓄积,可能成为比血清、尿液更好的生物标志物。因此,本研究拟建立毛发中吡咯加合物的测定方法,监测长期正己烷暴露大鼠毛发吡咯加合物的变化和大鼠行为学改变,比较血清、尿液、毛发吡咯加合物与神经损伤的相关性,计算毛发吡咯加合物的未见有害作业水平,并探究其作为正己烷中毒生物暴露限值的可行性。方法第一节毛发吡咯加合物浓度测定的方法建立使用2,5-HD浸泡大鼠毛发和人头发,建立含有吡咯加合物的毛发模型;使用不同方法消化毛发并测定吡咯加合物浓度,选择最适合稳定的方法,并进行精密度检测、加标回收率实验验证方法的可行性;测定2,5-HD浸泡毛发模型中吡咯加合物浓度;使用正己烷对大鼠染毒建立动物模型,在染毒期、染毒中期、染毒终点收集大鼠毛发,测定吡咯加合物浓度,并与大鼠的步态评分做Spearman’s相关分析。第二节确定毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平使用不同剂量正己烷对大鼠进行长期染毒,建立正己烷诱发周围神经病变模型;在染毒期和恢复期监测大鼠步态评分、转棒潜伏期和神经传导速度的变化;监测大鼠血清、尿液、毛发中吡咯加合物浓度变化;设立卫星组进行毒代动力学研究,计算血清、尿液、毛发中吡咯加合物的半衰期;进行多重回归分析选取最适合的行为学指标进行相关性分析,计算血清、尿液、毛发中吡咯加合物与神经损伤指标的偏相关系数,使用相关性最高的毛发吡咯加合物数据计算NOAEL值。结果第一节毛发吡咯加合物浓度测定的方法建立毛发吡咯加合物的测定方法可行,具有较高的精密度、加标回收率;体外条件下,毛发中吡咯加合物浓度与使用的2,5-HD浓度呈剂量依赖性(P<0.05);使用相同浓度2,5-HD处理的大鼠毛发和人头发相比,反应形成吡咯加合物的浓度无差异;正己烷处理的毛发与对照组无差异;长期正己烷染毒大鼠毛发内有吡咯加合物蓄积,呈剂量依赖性,并与神经损伤呈正相关:r=0.8507(P<0.05)。第二节确定毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平长期正己烷染毒大鼠毛发中吡咯加合物浓度变化缓慢,半衰期比血清、尿液中吡咯加合物更长,约为24.9±7.5周;毛发吡咯加合物浓度与大鼠神经损伤程度呈正相关(染毒期r=0.683,恢复期r=0.702)(P<0.05),且毛发吡咯加合物对步态评分的偏相关系数(染毒期0.324,恢复期0.322)高于血清(染毒期0.193,恢复期0.050)、尿液吡咯加合物(染毒期0.120,恢复期0.115);根据0.5 g/kg染毒组大鼠未出现任何神经损伤表现,计算出毛发吡咯加合物NOAEL值:275.2 ±61.5 nmol/g.protein。结论1.毛发吡咯加合物的测定方法稳定可行,可用于检测正己烷中毒;2.毛发中吡咯加合物浓度变化缓慢、半衰期长,与神经损伤相关性最高,可以作为一个特异、敏感、稳定的效应标志物;3.毛发吡咯加合物的NOAEL值:275.2±61.5nmol/g.protein,为人群生物暴露限值提供参考。第二章吡咯加合物蓄积在正己烷诱发周围神经病变中的作用目的1.验证吡咯加合物蓄积与正己烷诱发周围神经病变的因果关系;2.验证前一章大鼠毛发吡咯加合物NOAEL的可行性;3.探究钙离子相关通路在正己烷诱发周围神经病变中的作用方法第一节二烯丙基一硫拮抗正己烷诱发神经损伤的机制研究使用正己烷对大鼠染毒建立动物模型,干预组提前2小时使用50、100mg/kg剂量的CYP2E1抑制剂二烯丙基一硫(Diallyl sulfide,DAS)进行干预;监测染毒期各组大鼠的行为学改变,评估DAS对正己烷染毒大鼠的保护作用;检测大鼠血清、尿液、毛发、坐骨神经中吡咯加合物的蓄积,验证毛发吡咯加合物NOAEL的可行性;在实验中期进行毒代动力学研究探究DAS对正己烷体内代谢的影响;染毒结束后,收集大鼠坐骨神经制作病理切片观察坐骨神经损伤,收集大鼠肝脏检测相关代谢酶的表达和活性。第二节二烯丙基一硫增强2,5-己二酮神经毒性的机制研究使用正己烷、2,5-HD对大鼠进行染毒建立模型,使用100 mg/kg剂量DAS分别对2,5-HD、正己烷染毒大鼠进行干预;监测各组大鼠步态评分、转棒潜伏期的变化;设立卫星组进行毒代动力学研究,探究DAS对正己烷和2,5-HD代谢的影响;在染毒终点,收集大鼠肝、肾、脊髓、坐骨神经测定吡咯加合物浓度;制作坐骨神经病理切片检查神经损伤,并检测髓鞘相关蛋白的表达;提取脊髓、坐骨神经蛋白,检测钙蛋白酶系统和钙依赖性自噬相关蛋白的表达;建立2,5-HD染毒的小鼠神经瘤母细胞的细胞模型,分别使用DAS和自噬抑制剂氯喹进行干预处理,观察细胞损伤,测定细胞存活率、轴突长度和钙离子浓度。结果第一节二烯丙基一硫拮抗正己烷诱发神经损伤的机制研究行为学及电生理改变:正己烷模型组大鼠在染毒期间出现了步态评分升高、转棒潜伏期下降、神经传导速度下降,而DAS低、高剂量干预组大鼠的行为学表现与模型组相比明显改善,步态评分下降、转棒潜伏期升高、神经传导速度升高(P<0.05);坐骨神经病理检查:DAS的干预使大鼠坐骨神经损伤减轻,表现为坐骨神经切片中空泡样病变明显减少,组织结构更加致密完整;吡咯加合物浓度变化:与正己烷模型组相比,DAS低、高剂量干预组血清、尿液、毛发、坐骨神经吡咯加合物浓度均下降,呈剂量依赖性(P<0.05);毒代动力学改变:DAS干预使得正己烷在大鼠体内代谢活化减少,表现为血清内2,5-HD、吡咯加合物水平下降,并且DAS干预组血清中2,5-HD、吡咯加合物半衰期变短,呈剂量依赖性(P<0.05);肝脏内代谢酶的表达和活性改变:与正己烷模型组相比,DAS干预降使肝脏内CYP2E1的表达下降、活性下降,呈剂量依赖性(P<0.05);与正己烷模型组相比,DAS干预使肝脏内NQO1的表达升高、活性升高,呈剂量依赖性(P<0.05);与正己烷模型组相比,DAS干预使肝脏内GSTT1的表达升高、活性升高,呈剂量依赖性(P<0.05)。第二节二烯丙基一硫增强2,5-己二酮神经毒性的机制研究行为学改变:与2,5-HD模型组相比,DAS干预2,5-HD组周围神经损伤发展更快,在第三周组内所有大鼠出现瘫痪,而DAS干预正己烷组大鼠行为学表现未出现异常变化;吡咯加合物浓度变化:DAS干预2,5-HD组大鼠坐骨神经内吡咯加合物浓度是2,5-HD模型组的2倍,而DAS干预正己烷组大鼠坐骨神经内吡咯加合物浓度相比正己烷模型组下降;毒代动力学改变:DAS能减少正己烷的代谢活化,减少2,5-HD、吡咯加合物的形成,但对于2,5-HD没有直接作用;坐骨神经损伤:2,5-HD、正己烷模型组大鼠坐骨神经出现了结构紊乱和空泡样改变,DAS干预2,5-HD组结构更加紊乱,而DAS干预正己烷组未见明显损伤;与2,5-HD模型组相比,DAS干预2,5-HD组髓鞘相关蛋白MBP升高95.8%;钙离子相关通路蛋白表达:在2,5-HD模型组、正己烷模型组坐骨神经中,钙蛋白酶系统激活,DAS干预能进一步增加m-calpain、μ-calpain蛋白的表达;在2,5-HD模型组、正己烷模型组坐骨神经中,钙依赖性自噬激活,DAS的干预使自噬相关蛋白表达进一步增加;细胞实验结果显示,与2,5-HD模型组相比,DAS预处理使得2,5-HD染毒N2a细胞轴突变短、钙离子浓度升高(P<0.05),呈剂量依赖性,而氯喹干预使2,5-HD染毒细胞轴突长度增加(P<0.05)。结论1.吡咯加合物在坐骨神经中蓄积导致神经损伤,呈剂量依赖性;2.DAS通过抑制大鼠肝脏内CYP2E1的表达和活性,减少体内2,5-HD的形成,从而减少吡咯加合物的蓄积保护坐骨神经,具有长期使用预防正己烷诱发神经病变的潜力,但DAS的使用必须在正己烷暴露之前才能达到预防目的;3.蓄积在坐骨神经中的吡咯加合物可能通过升高细胞内钙离子浓度,激活钙蛋白酶系统,对神经细胞造成损伤,而钙依赖性自噬的过度激活会加重神经损伤。第三章磷酸化TDP43积聚在正己烷诱发周围神经损伤中的作用目的拟检测2,5-HD染毒大鼠坐骨神经内吡咯加合物的蓄积和TDP43等相关蛋白的表达,探究坐骨神经内吡咯加合物引起神经损伤的信号通路和致病机制,为职业中毒预防和临床治疗正己烷诱发周围神经病变提供研究依据。方法使用不同剂量的2,5-HD对大鼠染毒建立模型;监测染毒期间各组大鼠步态评分、转棒潜伏期的变化;在染毒结束后对大鼠血清、毛发、坐骨神经内吡咯加合物进行定量分析;制作大鼠坐骨神经病理切片检测神经损伤,并使用免疫组化染色检测坐骨神经内p-TDP43蓄积;提取坐骨神经胞浆蛋白,测定TDP43、p-TDP43、内质网应激相关蛋白、钙蛋白酶、轴突损伤蛋白的表达;分别对对大鼠步态评分、坐骨神经内吡咯加合物、p-TDP43蛋白表达相关性分析,探究吡咯加合物和p-TDP43蓄积的关系。结果:行为学改变:与对照组相比,2,5-HD染毒组出现步态评分升高、转棒潜伏期下降,呈剂量依赖性(P<0.05);吡咯加合物浓度变化:与对照组相比,2,5-HD染毒大鼠血清、毛发、坐骨神经内吡咯加合物浓度升高,呈剂量依赖性(P<0.05);病理检查:染毒组大鼠坐骨神经病理切片显示出现空泡样改变和结构紊乱,免疫组化染色结果显示坐骨神经内有p-TDP43蓄积,呈剂量依赖性(P<0.05);TDP43蛋白表达:与对照组相比,2,5-HD染毒组大鼠坐骨神经TDP43表达增加、p-TDP43表达增加、多聚体p-TDP43/单体TDP43比例升高,呈剂量依赖性(P<0.05);内质网应激蛋白:与对照组相比,中、高剂量2,5-HD染毒组的PERK表达升高,低、中、高剂量组ATF4、CHOP表达升高(P<0.05);钙蛋白酶系统:与对照组相比,2,5-HD高剂量染毒组μ-calpain表达升高,2,5-HD中、高剂量染毒组的m-calpain表达升高,而2,5-HD低、中、高染毒组calpastain 表达降低(P<0.05);轴突损伤蛋白:与对照组相比:中、高剂量2,5-HD染毒组大鼠坐骨神经内轴突损伤蛋白SARM1表达升高,低、中、高剂量组轴突保护蛋白STMN2、NMNAT2 表达下降(P<0.05);相关性分析:坐骨神经内p-TDP43表达与坐骨神经吡咯加合物浓度、步态评分均呈正相关(P<0.05)结论1.在2,5-HD染毒大鼠坐骨神经内发现了 p-TDP43异常积聚,且与神经损伤呈正相关;2.坐骨神经内p-TDP43多聚体积聚呈剂量依赖性,并与吡咯加合物浓度呈正相关;3.吡咯加合物可能诱发p-TDP43形成异常积聚,激活内质网应激,升高细胞内钙离子浓度,激活钙蛋白酶系统对神经细胞造成损伤。