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豆科植物可以与根瘤菌形成共生固氮的关系,产生新器官——根瘤,并获得氮营养。近年来,研究人员从模式豆科植物中鉴定出一系列参与调控固氮共生的关键基因。其中,蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）富含亮氨酸重复序列的类受体激酶DMI2（Does not make infection 2）作为共受体参与对结瘤因子（Nod factor）的识别,从而激活侵染线形成、根瘤原基起始等相关固氮共生早期信号转导通路事件。因此,类受体蛋白激酶MtDMI2在固氮共生信号起始过程中起着至关重要的调节作用。为了研究MtDMI2在固氮共生信号起始过程中帮助识别结瘤因子信号,并将信号传递到植物细胞内部的分子机制。本实验室前期通过质谱分析及酵母双杂交技术发现,MtDMI2蛋白可能特异地与MtHIRs蛋白（Hypersensitive Induced Response Protein）相互作用。在此基础上,本研究进一步分析了MtDMI2蛋白与MtHIRs的蛋白相互作用,并探讨了MtHIRs蛋白在共生固氮早期信号传递中的作用机理,这对阐明固氮共生信号转导的机制有重要意义。具体研究结果如下:1.生物信息学分析发现:MtHIRs基因的五个同源基因都具有SPFH结构域（Stomatin Prohibitin Flotillin HflK/C domain）,属于BAND7蛋白家族。对蒺藜苜蓿MtHIRs家族中所有蛋白进行序列保守性分析发现,包括五个同源基因在内的亚家族比较保守,另一类的MtHIRs蛋白亚家族之间相对比较保守。对MtHIRs蛋白进行结构分析,发现MtHIRs蛋白可能是脂膜结合蛋白。数据库分析MtHIRs表达水平发现,不同的数据库分析的结果有所差异,但总的来说MtHIRs在根中的表达量比根瘤中的高。2.为了直观地观察和验证MtHIRs蛋白在根瘤形成前后的亚细胞定位情况,成功地构建了由自身启动子驱动的MtHIRs::GFP融合载体。将含有重组质粒的发根农杆菌Arqua1侵染蒺藜苜蓿野生型A17植株后,发现MtHIRs蛋白主要定位在植株根的细胞膜上,且在细胞膜上的定位不均匀,存在一定的极性分布。3.为了能够直观地观察在接种根瘤菌前后,MtHIRs基因的时空表达情况,将含重组质粒MtHIRspro-pMDC163的发根农杆菌Arqua1侵染蒺藜苜蓿野生型A17植株,结果发现MtHIRs基因在根中有明显的表达。4.为了验证MtDMI2与MtHIRs蛋白间的相互作用,成功地构建了荧光素酶互补的重组质粒和原生质体BiFc（Bimolecular fluorescence complementation）的重组质粒。并将构建好的荧光素酶互补的重组质粒Mt107720-nluc和Mt107730-nluc在烟草叶片中进行瞬时表达后,纯化获得含Myc标签的融合蛋白。通过Western Blot实验,得到40 KD的融合蛋白的条带,表明目的蛋白可以在烟草叶片中表达。5.成功地构建了CRISPR敲除载体MtHIR-gRNA1-pHSE401及MtHIR-gRNA2-pKSE401。并利用极限退火PCR对转化植株进行初步的鉴定。本论文对蒺藜苜蓿MtHIRs蛋白的功能及其与MtDMI2的关系进行了初步地分析,为后续全面揭示MtHIRs蛋白与MtDMI2的蛋白互作以及MtHIRs蛋白在固氮共生信号起始阶段的作用机制奠定了基础。