与大白菜桔红心性状连锁的RAPD和SCAR标记的探索

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:manacewj
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本研究以大白菜双单倍体(DH)群体为试材,结合混合分组分析法(BSA),筛选与桔红心性状连锁的分子标记, DH群体100个株系和78 F2单株验证筛选到的标记,并将获得的RAPD标记转化为SCAR标记。探索了利用分子标记进行桔红心球色辅助选择育种的可行性。为利用分子标记技术辅助高品质桔红心大白菜育种,加快育种进程提供了新的技术途径。具体结果如下:以大白菜普通白心株系91-112和桔红心株系T12-19产生的F1经小孢子培养得到的DH群体为试材,调查其球色分离情况,证实桔红心性状为一对隐性基因控制的简单遗传,现暂将桔红心基因定名为Or基因。摸索了大白菜DNA的提取方法。所获DNA完整,能被EcoRI酶切,其质量较高。能获得稳定可靠的PCR结果。分析了影响RAPD反应的主要因素。通过优化大白菜RAPD反应体系和反应程序,确定了反应体系中MgCl2与dNTP的最适用量和反应的最适退火温度,获得了较好的RAPD扩增结果。利用DH群体两亲本筛选能产生多态性的RAPD引物,筛选了25套500个Operon系列的10碱基引物,其中462个引物可扩增到清晰的条带,有效引物的比例为92.4%,谱带总数为2032条,平均每个引物扩增的谱带数为4.4条。双亲间有多态性差异的引物124个,经过2次重复,去掉重复性差的引物,得到双亲间稳定表现多态的引物97个。然后,在DH群体的59个桔红心植株和41个白心植株中随机各选8株,分别混合形成桔红心池与白心池,利用有差异的97个引物对两个池的DNA进行扩增,发现13个引物在两池间有差异谱带。但在打开池进行单株确证时,其中12个引物扩增的标记并不与桔红心基因连锁或连锁不紧密。只有引物OPB01(5’-GTTTCGCTCC-3’)产生的分子量为845bp的条带在桔红心池的各单株中存在,而在白心池的各单株中不存在,重复3次,结果一致,初步确定OPB01-845与桔红心球色基因存在连锁关系。用引物OPB01对DH群体进行扩增,扩增结果与田间球色鉴定吻合率为93%,交换率为7%,遗传距离为3.8cM,LOD值为19.05;对78 F2单株进行扩增,扩增结果与田间球色鉴定吻合率为89.7%。证明RAPD标<WP=6>记OPB01-845与桔红心基因呈紧密连锁。回收在桔红心池中扩出的特异片段OPB01-845,回收片段与pGEM-T Easy Vector质粒载体连接,转化大肠杆菌DH5α,成功的进行了克隆,然后对特异片段进行测序。根据测序结果,在两端设计一对20碱基特异引物。分别对DH群体及78 F2单株进行SCAR分析,其扩增结果与RAPD标记OPB01-845在DH群体及78 F2单株中的分离相一致,表明该RAPD标记已成功地转化为SCAR标记。SCAR标记SCB01-845在DH群体中、78 F2单株中与田间球色鉴定的吻合率分别为93%、89.7%, 90%左右的检测准确率运用到实际球色育种中,对于提高球色育种的效率已有相当大的保证。
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