骨骼是机体承担力学载荷的主要结构,具有应力适应性。正常生理水平应力能改善骨质量;而应力不足（如微重力环境及长期卧床等）会导致骨量快速流失。骨骼中的细胞通过力学信号转导过程感知外界应力并将其转化为机体内生化反应,调控骨代谢。骨力学信号转导异常可导致骨质疏松（OP）、骨关节炎等多种骨骼疾病的发生,严重影响人们生活质量,增加社会经济负担。因此,深入了解不同力学环境下骨力学适应机理及骨组织细胞响应和转导外界应力刺激的机制具有重要意义。骨细胞（OCY）约占骨中细胞总数的95%,是骨中核心应力“感受器”和骨重建的“调控器”。然而,不同力学环境下OCY的信号响应和转导机制目前尚不明确,这也是骨生物力学领域研究的热点和难点。研究已证实骨组织上的宏观应力载荷能诱导骨陷窝小管系统（LCS）内流体流动。因此,研究OCY对流体剪切力（FSS）的应答机制对理解骨力学信号转导过程具有重要意义。虽然课题组的前期研究揭示了OCY响应外界应力刺激的方式是将其编码为多尖峰钙振荡,但OCY如何解码和转导这种钙振荡?不同力学环境（如微重力、废用等应力不足状态）OCY钙响应差异特征是什么?是否能够以OCY钙振荡为切入点探寻特殊力学环境骨损伤的潜在分子干预靶标?以上关键问题仍未被解决。本研究首先基于三维有限元分析（FEA）技术,明确骨组织与OCY在响应不同水平载荷作用下的应变分布空间特征,构建宏观骨组织载荷与微观OCY所受FSS间的数值对应关系。其次,通过转录组学测序（RNA-seq）及实验筛选验证,系统研究生理水平FSS作用下OCY钙信号响应的解码转导机制,明确生理水平应力诱发的OCY钙振荡的核心解码器,并探索其对OCY响应应力能力及功能的调控作用。然后,通过“体外-离体-在体”相结合的思路研究模拟微重力作用的骨组织及OCY在经应力复载后力学敏感性降低的机制,筛选并确定潜在的干预靶标。本研究通过生物力学、细胞和分子生物学、矿化医学等多学科交叉的技术手段和思路,旨在进一步丰富对于骨应力适应性机制的科学认识,并能够为应力不足引起的骨损伤的临床治疗（如航天飞行的失重骨丢失、疾病长期卧床的废用性OP）提供新思路,兼具重要的科学研究意义和临床应用价值。整个研究主要分为以下四部分:第一部分:不同水平载荷对骨组织及OCY力学响应影响的仿真研究背景:骨组织所受的宏观载荷可使骨陷窝产生弯曲形变并引起OCY所处的LCS微环境中的组织液发生流动。然而,骨组织与OCY在不同载荷下的力学特征及宏观载荷与微观FSS间的对应关系仍需进一步明确。方法:基于Micro-CT数据并利用Mimics、Geomagic及ICEM软件重建小鼠胫骨FEA模型,使用MSC.Patran及MSC.Nastran对不同水平载荷下小鼠宏观骨组织的力学响应进行数值仿真研究。而后,在COMSOL软件中建立OCY模型进行流固耦合计算分析,得到不同水平载荷作用下OCY的组织液速度场。最后以所得速度场为边界条件计算得到不同水平载荷作用下OCY表面的FSS响应。结果:不同水平载荷作用下小鼠胫骨表面主应变空间分布规律相似,最大张应变与压应变均在胫骨骨干中部。对小鼠胫骨施加正常生理活动水平载荷9 N时（体重25g）,小鼠胫骨表面产生的最大张应变为1738με、最大压应变为-2297με;更高水平载荷16 N作用下,胫骨表面产生的最大张应变为3382με、最大压应变为-4729με。在微观OCY层面,不同水平宏观载荷作用下OCY所受的FSS空间分布特征相似,表现为中心细胞体受力相对较小,入口骨小管受力较大。9 N和16 N的宏观载荷在OCY中央细胞体产生的平均FSS分别为2 Pa和4 Pa。结论:小鼠胫骨在不同水平宏观载荷作用下应力-应变的空间分布特征为后续骨组织中原位OCY钙信号响应观察区域的确定提供了关键依据;骨在不同水平载荷作用下OCY的LCS中FSS空间分布特征和定量分析为下一步体外OCY力学响应和转导机制工作的开展提供了理论指导和参数支撑。第二部分:正常应力作用下OCY钙振荡的解码及转导机制研究背景:课题组前期首次发现体外和原位OCY在应力作用下表现出独特的多尖峰钙振荡特性,且OCY的应力敏感性远高于骨中其他细胞,提示骨骼通过OCY多尖峰钙振荡响应和处理外界应力刺激。但应力刺激下OCY这种独特多尖峰钙振荡的生理意义是什么?OCY如何解码和转导这种钙振荡?钙振荡对于OCY的细胞生物学功能以及骨重建的调控作用是什么?上述问题目前仍不得而知。明确应力作用下OCY钙振荡的下游核心解码分子对于深入认识骨力学信号转导机制具有重要意义。方法:首先分别对OCY细胞系（MLO-Y4）及钙信号通路拮抗剂预孵的OCY施加生理水平（2 Pa）FSS。通过RNA-seq、免疫荧光（IF）、蛋白免疫印迹（WB）及实时定量PCR（q RT-PCR）筛选OCY钙振荡的核心解码分子。随后,使用慢病毒干涉技术构建该解码分子基因沉默的MLO-Y4稳定转染细胞株。利用CCK8、Annexin-V/PI双染、RNA-seq、WB和q RT-PCR等技术对比上述稳定转染细胞株与正常MLO-Y4细胞在FSS作用下的细胞活性、凋亡情况及OCY力学生物学的变化差异。结果:对于文献报道的已知具有钙信号解码功能的分子时空表达检测分析发现（包括NFATc1-NFATc4、NF-κB、Ca MKII及MAPK）,体外OCY在FSS刺激下只有NFATc3和MAPK出现了显著核转位现象。使用拮抗剂抑制FSS诱发的钙振荡后,OCY中MAPK仍然发生核转位,而NFATc3不再发生核转位。同时,RNA-seq也发现抑制钙振荡的OCY中NFAT转录因子基因集被显著下调。上述研究结果共同提示NFATc3是应力作用下OCY钙振荡的核心解码分子。NFATc3沉默后,FSS对OCY细胞活力的促进以及凋亡的抑制作用消失。此外,RNA-seq结果提示NFATc3沉默后FSS可调控的MLO-Y4的差异基因数量显著减少,同时细胞的力学信号应答骨形成及骨吸收相关功能受到显著影响。q RT-PCR及WB结果进一步证实,NFATc3沉默后FSS对MLO-Y4中CTGF（Ccn2编码）及RANKL（Tnfsf11编码）的上调作用显著减弱。结论:NFATc3是应力诱发OCY多尖峰钙振荡的下游核心解码分子,且NFATc3对于OCY的力学信号转导以及OCY活性和功能的调控发挥着关键作用。本部分实验进一步丰富了对于骨和OCY力学信号响应和转导机制的认识,为深入阐明骨应力适应的机理提供了新思路。第三部分:模拟微重力作用的骨组织和OCY复载后应力敏感性衰退特征及其机制研究背景:太空飞行的宇航员在返地后会出现进行性的骨流失,多数终身难以恢复至正常水平,上述情况同样发生于长期卧床的废用性OP患者。前一部分实验已发现OCY的钙振荡及其解码在骨的应力响应和转导中发挥重要作用。然而微重力作用的骨骼在力学复载后OCY的钙响应和解码的变化特征是什么?微重力作用的骨组织和OCY复载后应力敏感性衰退机制是什么?解决上述关键问题能够为进一步明确微重力及废用等应力不足状态下的骨丢失机制提供新思路。方法:对3月龄骨成熟小鼠进行后肢悬吊4周（HLS组）,对照小鼠不施加后肢悬吊（GC组）,随后对全部小鼠右侧胫骨施加2周生理水平载荷,结束后取两侧胫骨分析骨表型。MLO-Y4细胞模拟微重力（SMG组）或正常培养（CON组）48 h,两组中各取部分细胞进行凋亡、活性、RNA-seq与能量代谢检测。另一部分细胞爬片后进行体外OCY钙信号采集与FSS同步加载实验。同时应用原位OCY钙信号成像和应力加载同步技术观察HLS组的小鼠胫骨应力复载钙信号响应。此外,对经生理水平FSS刺激后的SMG组与CON组细胞进行q RT-PCR、WB及IF实验。结果:HLS组小鼠胫骨经应力复载后其骨量、骨小梁微结构、骨形成和OB生成的增强程度、OCY活性的改善水平均显著低于GC组小鼠;GC组小鼠胫骨经应力复载后骨吸收和OC活性功能显著降低,而HLS组无变化。模拟微重力的体外及原位OCY对应力复载的钙振荡响应显著减弱,且NFATc3不再出现核转位现象。同时,FSS诱导SMG组中细胞β-catenin、OPG与OCN表达的上调能力及DKK1的下调能力均显著低于CON组。进一步的RNA-seq与能量代谢检测实验发现,模拟微重力对OCY总葡萄糖摄取量无显著影响却显著降低了其胞内及胞外ATP水平。SMG组细胞氧化磷酸化水平显著降低,糖酵解显著增强,SMG组胞内谷氨酰胺（Gln）水平显著下降。结论:模拟微重力主要通过将OCY的葡萄糖代谢途径由氧化磷酸化转化为糖酵解,降低了ATP的产生;而ATP是介导OCY应力钙振荡响应的核心信号分子,因此导致了模拟微重力作用的OCY复载后应力钙响应能力的降低,从而引起骨组织复载后应力敏感性的显著衰退。因此,改变模拟微重力作用的OCY的糖代谢模式可能是提升骨组织复载应力敏感性的关键途径。第四部分:补充Gln对于模拟微重力作用的骨组织和OCY复载后应力敏感性衰退的干预效果研究背景:前一部分实验已发现模拟微重力通过将OCY的代谢途径由氧化磷酸化转化为糖酵解,降低了ATP的产生,从而降低了OCY的应力敏感性。Gln驱动的氧化磷酸化是细胞在常氧和低氧环境下的一个主要ATP来源,且前部分实验中我们发现了模拟微重力作用的OCY中Gln的水平显著降低。因此,本部分研究旨在探索补充Gln是否能够缓解模拟微重力作用的骨组织和OCY复载后应力敏感性的衰退。方法:对后肢悬吊4周的小鼠尾静脉注射Gln（每天673 mg/kg,连续注射1周）,同时对其右侧胫骨施加2周的生理水平载荷。结束后取两侧胫骨,对骨的微结构、骨代谢及骨中细胞活性进行分析。对补充了Gln的后肢悬吊小鼠胫骨进行应力复载下的原位OCY钙信号实验。另外,对经模拟微重力48 h后恢复重力并在含4 m M Gln的完全培养基中培养7 d的MLO-Y4（SMG+GLN组）进行ATP检测实验、应力复载后的体外OCY钙信号实验及NFATc3的入核检测实验。结果:补充Gln可显著提高应力复载对后肢悬吊小鼠胫骨骨微结构、骨代谢及骨中细胞活性的改善作用,同时显著提高后肢悬吊小鼠胫骨在应力复载下的原位OCY钙信号响应能力。补充Gln可显著增加SMG+GLN组OCY胞内及胞外ATP水平。SMG+GLN组OCY在应力复载下的钙信号响应能力显著增强同时NFATc3发生核转位现象。结论:补充Gln可有效提高模拟微重力作用的OCY复载后应力钙响应能力,从而提升模拟微重力作用的骨组织复载后的应力敏感性。本部分研究有望为解决宇航员、长期卧床病患等应力不足人群骨损伤恢复困难的问题提供新思路。