百草枯(Paraquat, PQ)又名克芜踪、对草快,是一种光谱、触杀型有机杂环类除草剂,对人畜有剧毒。随着全球范围内相继出现百草枯中毒事故,各国管理部门开始重新考虑百草枯的健康危害,越来越多的学者也开始关注百草枯暴露对机体尤其是神经系统造成的损伤以及相关机制。近年来,许多大样本病例对照研究针对帕金森病患者的可能诱因进行了多因素分析,结果表明,既往的职业除草剂应用史是最主要的危险因素。同时,随着对百草枯相关研究的深入,动物实验也已经证明,百草枯对小鼠的中枢神经系统有明确的毒性作用,发现百草枯慢性暴露的神经毒性作用多发生在中脑黑质纹状体的多巴胺系统。然而,目前针对亚急性暴露于百草枯造成多巴胺能神经系统损伤的相关研究仍旧缺乏,对于发育期暴露于百草枯所引发的毒性作用的关注也少之又少。基于以上背景,本研究通过开展整体动物实验,探讨发育期小鼠百草枯亚急性暴露对多巴胺能神经系统的影响,进一步补充和完善百草枯的神经毒作用机制。将80只出生21天(断乳)C57BL/6J小鼠随机分为对照组(生理盐水组)、极低剂量组(PQ 1.25mg/kg)、低剂量组(PQ 2.5mg/kg)、中剂量组(PQ 5mg/kg)、高剂量组(PQ 10mg/kg),每组各16只。每日经口灌胃染毒一次,连续进行30天。染毒结束后,采用Morris水迷宫实验测试成年后小鼠主动学习记忆功能,水迷宫实验结束5天后,采用避暗实验测试小鼠的被动学习记忆能力。整个实验期间密切观察小鼠的一般行为表现并于神经行为学测试结束后采集小鼠组织标本,包括脑、心、肝、肺、肾,计算脏器系数。同时,利用HE、甲苯胺蓝染色进行中脑组织病理学观察,并通过透射电镜进行中脑组织超微结构观察。最后,采用实时荧光定量PCR检测小鼠中脑多巴胺系统相关基因mRNA的表达变化,并利用Western blot观察神经元凋亡相关蛋白通路变化,探究相关机制。研究结果显示,PQ染毒期间,各组小鼠一般情况良好,毛色光洁度、活力、步态、分泌物、眼外观、呼吸、神态等表现无异常。各组小鼠体重均呈现稳步上升趋势,对体重数据进行统计分析显示,同对照组相比,各剂量组小鼠体重的变化差异无统计学意义《p>0.05)。脑、心、肝、肺、肾的脏器系数结果显示,各染毒组脏器系数与对照组相比,差异均不具有统计学意义(p>0.05)。以上结果说明在本次研究的染毒条件下,为期30天的百草枯重复暴露对小鼠的一般状况没有明显影响。1.对神经行为功能的影响在Morris水迷宫实验中,无论是小鼠在空间探索实验中的潜伏期,还是小鼠穿越平台位置的次数,或是小鼠在原平台象限游泳的时间占总时间的百分比,各剂量组间的差异均不具有统计学意义(p>0.05)。提示在本次研究的暴露条件下,发育期小鼠亚急性暴露于百草枯不会影响成年期小鼠的主动学习记忆功能。避暗实验的结果显示,随着染毒浓度的增加,各染毒组小鼠的避暗潜伏期逐渐延长,与对照组相比,高剂量组小鼠潜伏期的延长具有统计学意义(p<0.05)。提示百草枯能够影响小鼠的短时被动学习记忆能力。2.小鼠组织病理改变利用HE、甲苯胺蓝染色进行中脑组织病理学观察,光镜下,可见高剂量组黑质细胞明显减少,说明本研究中百草枯对多巴胺神经系统造成了病理损伤。透射电镜下,仅于高剂量组一例样本中观察到凋亡的神经元细胞,细胞核内出现染色质边集。其他染毒组小鼠中脑组织超微结构正常,视野内清晰可见神经元、胶质细胞以及神经纤维。3.对中脑多巴胺系统相关基因表达水平的影响对多巴胺系统转运相关基因mRNA表达水平的检测发现,与对照组相比,百草枯染毒组小鼠中脑组织DAT和VMAT2的mRNA表达量均存在明显差异(p<0.05)。其中,DAT的mRNA表达量随着百草枯染毒剂量的升高而降低。VMAT2的mRNA表达量在极低剂量的PQ染毒下升高,但差异没有统计学意义；而在低、中、高剂量的PQ染毒后出现下降,且差异具有统计学意义(p<0.05)。多巴胺转运相关基因的表达情况说明,发育期小鼠亚急性暴露于百草枯会导致成年期多巴胺转运相关基因表达水平的降低,从而影响成年期小鼠中脑多巴胺的转运。对多巴胺系统代谢相关基因mRNA表达水平的检测发现,百草枯染毒后,TH基因mRNA的表达水平在中、高剂量组随着百草枯染毒剂量的增高而明显降低(p<0.05),相反,COMT表达量在低、中、高三个剂量组则明显升高(p<0.05)。而MAOB基因mRNA的表达水平没有明显变化(p>0.05)。说明,在本研究的暴露条件下,小鼠多巴胺代谢相关基因的表达水平已经受到了影响。4.对中脑凋亡相关蛋白表达的影响Western blot分析结果显示,细胞凋亡过程中的关键蛋白Caspase9的蛋白表达量极低,各组差异没有统计学意义。同样,来自BcI-2家族,通过促进或抑制Caspase的激活参与凋亡调控的Bax蛋白,其表达量也在极低的水平,各组差异没有统计学意义。Western blot的结果说明,在本研究的实验条件下,发育期小鼠亚急性暴露于百草枯不会改变成年期特定凋亡通路相关蛋白的表达水平,黑质纹状体细胞的减少可能是通过其他凋亡通路来实现的。以上结果表明,发育期小鼠亚急性暴露于百草枯在体重、脏器系数、主动学习记忆功能等方面均未有明显的毒作用效应,但会导致成年期多巴胺转运及代谢相关基因表达水平发生变化,同时诱导成年期中脑黑质细胞的减少,产生“沉默毒性”的早期表征。这种神经细胞的减少和凋亡会造成神经元总量的降低,随着年龄的增长,相比于未暴露的动物,可能导致机体更早出现神经系统疾病的表征。以上结果为PQ的“沉默毒性”效应的验证提供了线索和参考,有助于进一步完善百草枯神经毒作用机制。