纳米抗体来自骆驼科动物体内一种天然缺失轻链的单域重链抗体的可变区,即重链抗体的重链可变区（Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH）,其直径约2.5 nm、长度约4 nm。它具有水溶性高、热稳定性强、免疫原性低、易表达等优点,广泛用于医疗诊断、食品安全、生物技术等领域。特异性纳米抗体通常采用噬菌体展示、核糖体展示等分子展示技术从抗体文库中筛选,然后将编码基因克隆至表达载体进行重组表达。根据研究目标的不同,如果亲和力、稳定性、人源化等性能不满足要求,还需要进行体外突变和改造。在这一过程中,涉及大量的分子克隆、转化、蛋白纯化等实验步骤,耗时耗力,工作效率低。本研究将无细胞蛋白质合成系统（Cell-free protein synthesis,CFPS）与生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry,BLI）结合,建立了一种可以快速比较纳米抗体亲和力的方法。该技术依托无细胞表达平台,无需构建表达载体即可快速获得纳米抗体蛋白,用于Bl Itz系统亲和力的测定,极大缩短了测定纳米抗体亲和力的时间,简化了实验步骤,主要研究内容如下:1.基于大肠杆菌系统无细胞表达平台的建立采用多序列比对的方法对文献报道的表达模板启动子序列进行了比对,收集部分不同的启动子序列进行了无细胞表达,分别以GFP、Tag BFP、Tag RFP蛋白为报告蛋白并进行了荧光光谱测定,结果显示以p RSETB质粒来源的启动子序列作为模板,可以表达得到Tag BFP蛋白,后续以p RSETB来源的表达框作为模板,优化无细胞表达体系。采用超声破碎的方法制备了具有活性的S30大肠杆菌抽提物,以p RSETB质粒启动序列至终止序列的线性片段为模板,Tag BFP荧光蛋白为报告蛋白,对菌株类型、培养基类型、培养温度、收获时间、破碎条件、Run-off反应时间等条件进行了单因素优化实验,单因素优化后的大肠杆菌抽提物制备条件为:使用BL21*（DE3）菌株、2×YTP培养基培养、温度37℃培养、培养菌液OD600至0.75时收获、破碎施加600 J能量,不进行Run-off反应。对反应体积、反应温度、反应时间、模板浓度、Mg2+浓度等无细胞表达条件进行了单因素优化,优化后的无细胞表达条件为:1.5 m L离心管中设置15μL反应体积、反应温度37℃、反应时间4 h、模板浓度20 ng/μL、Mg2+浓度10 m M。在优化后的实验条件下,Tag BFP表达量为630μg/m L,比优化前提高了9.57倍。2.抗AFB1纳米抗体突变子的构建及活性鉴定采用蛋白质设计软件evo Design分析得到了9个突变后可能提高抗黄曲霉毒素纳米抗体亲和力的关键位点,通过Over-lap PCR构建了9个位置的单点突变。采用间接phage-ELISA和间接竞争phage-ELISA对突变体的生物活性进行了鉴定。间接phage-ELISA结果显示,与野生型相比9种突变体对于人工抗原AFB1-BSA的结合活性均有增强。间接竞争phage-ELISA结果显示,突变体A57F的IC50值较野生型降低5%,其余突变体IC50值均上升。3.突变纳米抗体快速筛选方法的建立选取5个突变体（T50A、T50S、W52H、A57F、S103P）和野生型抗黄曲霉毒素纳米抗体（WTG8）,采用Over-lap PCR构建了抗黄曲霉毒素纳米抗体融合绿色荧光蛋白的重组蛋白的无细胞表达模板,并通过无细胞表达获得具有活性的重组蛋白。同时,构建了5个突变体及野生型蛋白的原核表达质粒,通过大肠杆菌表达、亲和纯化,获得了6种具有活性的重组蛋白。采用BLI单浓度检测方法测定了无细胞表达获得的重组蛋白的亲和力,同时采用BLI多浓度检测方法对纯化的重组蛋白进行了亲和力测定。无细胞表达与传统方法得到的亲和力数据的皮尔森相关系数为0.968,提示建立的无细胞亲和力筛选方法结果与传统方法显著相关,可用于纳米抗体突变体的快速筛选与亲和力对比。