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瞬时表达是一种将外源基因导入宿主细胞后短时间内过量表达目的基因的研究方法,其主要应用于蛋白质亚细胞定位、基因互作和基因的高通量表达等方面。目前应用于植物中的瞬时表达系统根据据操作方法可分为PEG法,基因枪法,农杆菌介导法和病毒介导法等,其中农杆菌介导法因其能够操作方便和转化效率较高而被广泛研究。目前在拟南芥和烟草中的瞬时表达系统研究的较为成熟,但是在油菜中的研究较少,主要是因为没有一个能够简便高效的瞬时表达系统被建立起来。通常建立一个高效的转化体系在确定了基本的技术参数指标后,需要逐步优化包括菌种的选择、菌液浓度、诱导条件和表达时间等影响因子,而本研究为了能够获得在科研生产上应用的高效油菜瞬时表达系统,便系统的对这些影响因子进行了研究并对已经构建好的系统进行了充分的验证,取得了以下结果:
1.选用甘蓝型油菜子叶作为转化的受体,并对其进行GUS染色分析,未检测到油菜子叶中有本地水平的GUS的表达,从而确定了GUS基因在油菜子叶中可以作为进行农杆菌介导法的报告基因;将携带载体pCAMBIA2301(携带GUS基因)的农杆菌GUS染色分析,也为检测到GUS表达的信号,从而确定了载体pCAMBIA2301可用于瞬时转化,为后续工作奠定了基础。
2.选用农杆菌GV3101,LBA4404和EHA105对油菜子叶的侵染能力进行比较,发现GV3101注射过的油菜子叶GUS活性最强,是LBA4404的6.5倍,是EHA105的13倍,从而证明了农杆菌菌株GV3101较适合油菜子叶的转化。
3.对影响农杆菌转化效率的农杆菌侵染浓度和瞬时表达的孵育时间进行分析,确定了在GV3101侵染液浓度OD600为0.8的条件下转化效率最高,在第4天时目的基因的瞬时表达量最高。
4.成功的应用这一瞬时表达系统在油菜中进行了EGFP和DsRED的亚细胞定位研究和蛋白FGL和PR的蛋白互作研究,证明了本实验室所构建的油菜子叶瞬时表达系统的可行性,为进一步研究油菜的各种基因功能打下了坚实的基础,同时对外源基因的瞬时表达研究提供了有力的工具系统。