应用PR8流感病毒为疫苗载体，将腺病毒六邻体保护性抗原表位重组到PR8流感病毒NS1基因中，拯救表达腺病毒六邻体保护性抗原表位的重组PR8流感病毒嵌合疫苗，并观测其免疫保护效果。在此基础上应用冷适应、减毒流感病毒株为载体，将腺病毒六邻体保护性抗原表位重组到冷适应、减毒流感病毒NA基因中，拯救表达腺病毒六邻体保护性抗原表位的重组冷适应、减毒流感病毒嵌合疫苗，并观测其免疫原性及免疫保护效果。　　本研究主要包括以下二部分内容：　　第一部分、以PR8流感病毒为载体的rFLU/HAdV/NS1-H疫苗候选株的初步研究　　方法与结果：　　1.应用反向遗传学技术，以流感病毒PR8为载体，将HAdV六邻体蛋白抗原表位的基因插入流感病毒非结构蛋白NS基因中，构建重组质粒NS1-Hexon，将重组质粒与PR8流感病毒其他7个基因组质粒共转染COS1-MDCK共培养细胞，经HA、RT-PCR、间接免疫荧光（IFA）、WB、电镜等方法证明拯救出的重组病毒为rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株。　　2.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株接种鸡胚扩增、30％-60%蔗糖密度梯度纯化，测定其血凝效价为215，每1mL rFLU/HAdV/NS1-H病毒液含有1×106.5TCID50单位，其抗原蛋白含量为6.15mg/mL。　　3.选用6周龄的雌性BALB/c小鼠，接种rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株为实验组，同时设立104TCID50和105TCID50两个剂量组，并用0.01M PBS为对照组。小鼠按20μL/只剂量进行滴鼻免疫，0、28天，免疫两次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴细胞悬液。应用微量中和法、ELISA法测定免疫小鼠血清针对PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗体效价以及针对HAdV-3的抗体亚型IgG、IgG1和IgG2a滴度；应用ELISPOT法测定小鼠脾淋巴细胞悬液针对PR8流感病毒和HAdV-3细胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平；应用ELISA法测定小鼠肺鼻灌洗液针对HAdV-3特异性的sIgA抗体效价。结果表明，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株在小鼠体内能够产生针对PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗体，产生针对HAdV-3的体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫反应，与PBS对照组比较差异显著（p<0.05或p<0.01）。同时，105TCID50剂量组免疫效果优于104TCID50剂量组。　　4.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，A/PR/8/34(H1N1)流感病毒和HAdV-3病毒进行攻毒，结果显示，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株能够明显减轻PR8流感病毒和HAdV-3病毒感染后症状、有效降低肺鼻的病毒载量、显著改善肺组织的病理病变情况，保护小鼠抵抗PR8流感病毒的致死性攻击。　　结论：　　成功拯救rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株，其能够刺激小鼠机体产生较好的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫效应。rFLU/HAdV/NS1-H免疫的小鼠对HAdV-3攻毒具有较好的保护效果。　　第二、以冷适应减毒A/California/07/2009流感病毒为载体的rFLU/HAdV/NA-H减毒疫苗候选株的初步研究　　方法与结果：　　1.将验证的HAdV六邻体蛋白的抗原表位基因插入A/California/07/2009流感病毒表面基因NA特定位点中，构建重组质粒NA-Hexon，以A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)型流感病毒为骨架病毒，将其6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M、NS)与A/California/07/2009流感病毒HA基因及重组质粒NA-Hexon构建到双向表达载体pAD3000上，共转染COS1-MDCK共培养细胞，经HA、RT-PCR、WB、电镜等方法证明拯救出的重组病毒为rFLU/HAdV/NA-H疫苗株。　　2.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株接种鸡胚扩增，经30%-60%蔗糖密度梯度纯化，测定其血凝效价为216，每1mL rFLU/HAdV/NA-H病毒液含有1×107TCID50单位，其抗原蛋白含量为7.32mg/mL。　　3.6周龄的雌性BALB/c小鼠，接种rFLU/HAdV/NA-H疫苗株为实验组（设立105TCID50和106TCID50两个剂量组），并用0.01M PBS为对照组。小鼠按20μL/只剂量进行滴鼻免疫，0、28天，免疫两次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴细胞悬液。应用微量中和法、ELISA法测定免疫小鼠血清针对BJ501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗体效价以及针对HAdV-3和HAdV-7的抗体亚型IgG、IgG1和IgG2a滴度；应用ELISPOT法测定小鼠脾淋巴细胞悬液针对BJ501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒细胞因子IL-4和IFN-γ水平；应用ELISA法测定小鼠肺鼻灌洗液中针对HAdV-3和HAdV-7特异性的sIgA抗体效价。结果表明，rFLU/HAdV/NA-H疫苗株在小鼠体内能够产生针对BJ501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗体，产生针对HAdV-3和HAdV-7的体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫反应，与PBS对照组比较差异显著（p<0.05或p<0.01）。同时，106TCID50剂量组免疫效果优于105TCID50剂量组。　　4.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，选用BJ501(H1N1)流感病毒和HAdV-3、HAdV-7病毒进行攻毒，结果显示，rFLU/HAdV/NA-H疫苗株能够明显减轻感染症状、有效降低肺鼻的病毒载量，保护小鼠抵抗BJ501流感病毒的致死性攻击。　　结论:　　成功拯救冷适应、减毒重组rFLU/HAdV/NA-H疫苗株，其能够刺激小鼠产生较好的体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫应答，并且对同亚型病毒具有较好的免疫保护效果。嵌合HAdV六邻体蛋白抗原表位的冷适应、减毒重组rFLU/HAdV/NA-H疫苗株是一个具有发展前景的腺病毒候选疫苗株。