肢体缺血再灌注(IR)损伤常发生于肢体挤压伤、肢体高位离断再植、腹主动脉瘤手术等患者的转归过程中。肢体缺血的时间越长,IR损伤表现越重,严重者可引起肢体坏死,不得已而行截肢手术。更严重的是,由缺血区组织细胞产生释放的活性氧物质及炎症介质可引发全身性IR损伤,进而引起肾等多器官功能障碍。因此,及早采取有效措施防治肢体IR损伤是整体救治的重要环节。研究表明,信使分子一氧化碳(CO)具有抗炎、抗氧化损伤的重要功效,在机体遭遇器官IR损伤的病理过程中,CO发挥细胞保护作用。本课题组先前的研究证实,给予适量外源性CO可有效减轻大鼠肢体IR损伤。但前期研究所用动物模型的肢体缺血时间为4 h,缺血程度相对较轻。给予外源性CO对肢体严重IR损伤有何影响,尚需进一步观察研究。目的:本实验拟通过夹闭大鼠股动脉8h再开放的方法复制肢体严重IR损伤模型,使模型动物吸入含CO的医用空气后,观测血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肢体湿干(W/D)重比值和病理学指标的变化,以探讨吸入CO对肢体严重IR损伤的效应,为最终将吸入CO的办法应用于防治肢体严重IR损伤提供实验依据。方法:(1)动物分组:健康、清洁、雄性SD大鼠56只,随机分为IR组(24只)、IR +CO(RC)组(24只)、假手术(S)组(8只)。在IR、RC组中,8只用于10 d存活率的观测;8只于再灌注6 h时取材,另8只于再灌注12 h时取材,用于LDH、CK、肢体W/D和病理学指标的观测。S组中,4只与再灌注6 h组对比观测,另4只与再灌注12 h组对比观测。(2)模型复制:本实验采用无创血管夹在双侧后肢根部夹闭股动脉,并用橡皮筋绑扎后肢根部,以此造成双侧后肢缺血。根据文献提示,并经本实验证实,缺血达8 h以上者再灌注后血压下降,呈现休克表现。据此,本实验将缺血时间确定为8 h,以此建立肢体严重IR动物模型。S组动物模拟手术过程,但不造成肢体缺血。(3)吸入CO的方法:RC组动物吸入CO,把动物置于特制的器皿中,通入含有CO的医用空气,CO的体积分数为0.075%。于再灌注前2 h时开始持续吸入含有CO的医用空气,直至再灌注后4 h,共计吸入6 h。S、IR组暴露于空气中,自由呼吸。(4)10 d存活率观测:IR、RC组各取8只大鼠,于再灌注过程中,观测尾动脉收缩压的变化和10 d存活率。(5)血清LDH、CK活性测定:IR、RC组,分别于再灌注6 h、12 h时,S组于对应的手术后时间点,在深度麻醉下经右心房采血各5mL,静置,离心,取上清液送全自动生化分析仪检测血清LDH、CK活性。(6)肢体W/D重比值测定:上述动物经心房采血后,把左侧后肢从髋关节处截断,用电子分析天平测量其湿重,在60℃电热恒温培养箱中干燥7天,待水分完全析出后测其干重,算得W/D。(7)病理学观察:从髋关节处截取上述动物右侧后肢,对肢体肿胀程度、皮下渗出情况及坏死粘连程度、肌肉颜色、质地等进行大体观察。其后,剥去皮肤,将小腿部分进行固定,把小腿三头肌切成组织块,石蜡包埋、切片,HE染色,光镜观察肌组织病理学变化。结果:(1)大体观察结果:S组,肢体形态大小正常,皮下无出血及渗出物,肌肉颜色暗红、弹性好。IR组,肢体明显肿胀,皮下组织内、肌间隔内有血色渗出液,并可见大量浅黄色、胶状渗出物,肌肉色泽深暗,成褐色,弹性差。RC组,肢体的肿胀程度较IR组明显减轻,皮下组织、肌间隔内血色渗出液及胶状渗出物明显减少,肌肉颜色较IR组显苍白,弹性中等。(2)肢体W/D重比值:S组,W/D最低,IR组W/D最高,RC组W/D居中。IR组和RC组相比,RC组和S组相比,均有统计学差异(P<0.05)。(3)HE染色观察结果:S组,骨骼肌细胞形态正常,胞浆均匀、红染,胞核无变形,核仁清晰;肌束明显,胞间无炎性细胞浸润。IR组,骨骼肌细胞胞体增大,部分肌细胞变性、坏死,肌浆溶解、破坏,胞核消失,呈空泡状;肌束断裂,胞间有大量的中性粒细胞浸润,并广泛出血。与再灌注6 h相比,再灌注12 h者病理表现更为严重。RC组,可见部分肌细胞变性,肌浆含有空泡,呈灶状溶解,大部分肌细胞肿大程度减轻,肌浆染色接近正常,胞核染色及位置趋近正常,未见核固缩;骨骼肌细胞间有少量单核细胞浸润,出血减轻。(4)血清LDH和CK活性检测结果:6 h取材者:IR组和RC组相比,有统计学差异(P<0.05);RC组和S组相比,无统计学差异(P>0.05);12 h取材者:IR组和RC组相比,RC组和S组相比,均有统计学差异(P<0.05)。(5)10 d存活率:IR组,再灌注后大鼠尾动脉收缩压开始降低,其下降过程可区分为四个时相:第一时相,再灌注0-2 h,为血压快速下降期,至2 h前后,尾动脉平均收缩压为8.6708±0.5992 kpa;第二时相,再灌注2-4 h,下降幅度较小,为血压相对稳定期;第三时相,再灌注4-8 h,为血压缓慢下降期,至再灌注8 h时尾动脉平均收缩压为5.3259±0.3832 kpa;第四时相,再灌注8 h-死亡,为持续低血压期,尾动脉收缩压波动在5 kpa上下,动物处于持续休克状态,再灌注13-14 h间有6只大鼠死亡,另外2只再灌注至20 h前后死亡,10 d存活率为0。RC组,尾动脉收缩压的下降速率较慢、下降幅度较小,与IR组的四个时相比照:第一时相,血压也快速下降,但下降幅度显著变小,再灌注至2 h前后,尾动脉平均收缩压为10.3843±1.3111 kpa;第三时相,血压下降的速率和幅度均明显降低,至再灌注8 h时尾动脉平均收缩压为8.3300±0.4224 kpa;第四时相,血压未出现下降,且稳中有升,至再灌注13 h时尾动脉平均收缩压为9.4157±0.3305 kpa,8只大鼠中1只在再灌注至20 h前后死亡,其余7只再灌注10 d后仍存活,且状态良好,10 d存活率为7/8。结论:(1)大鼠肢体缺血8 h者,再灌注过程中血压明显下降,出现休克表现,10 d存活率为0。据此认为,使大鼠两侧后肢持续缺血8 h行再灌注,以此可复制肢体严重IR模型。(2)及早给予外源性低浓度CO,可稳定动物血压,防止休克发生,显著提高肢体严重IR损伤大鼠的生存率。(3)及早给予外源性低浓度CO,可显著减轻肢体IR损伤,降低肢体的伤残率。