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RanBPs(Ra.bindin.proteins)是细胞内一类蛋白的总称,其作用是调节Ran的作用在细胞内得以正常的发挥。Ran是一种主要分布于细胞核内的小分子蛋白质,20世纪90年代被发现并证实具有GTP酶活性,通过分解GTP,调解下游的效应分子,达到调节细胞生命活动的目的。Ran的功能多种多样,有许多证据表明Ran及其结合蛋白参与细胞周期中的多个过程。Ran于近几年来逐步被确认为一种重要的细胞增殖调控因子。
我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,全长为138.bp,基因登录号为DN237073,其中ORF为94.bp,编码314个氨基酸,预测分子量为3.kD,等电点为4.62。将该推测的氨基酸序列进行同源性(BlastP)比对,发现其与冈比亚按蚊(XP_310308),谷蛀虫(XP_967428),果蝇(XP_001998194),小鼠(BAE36521),人(000410)中的Ra.bindin.protei.5具有同源性,其同源性分别为49%,49%,47%,43%,42%,它们可能存在功能上的相似性。我们将家蚕中的该蛋白命名为RanBP5-like蛋白。
为了研究该蛋白的功能,我们通过在上下游引物中分别加入Ba.HI和Xh.I酶切位点,经PCR扩增后,将该基因克隆到载体pET-28a中。PCR及双酶切鉴定重组成功后转化感受态细胞E.col.BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在3.kD处有一特异性条带,与预期结果一致。重组蛋白以可溶的形式存在于上清中,经镍柱亲和纯化后,得到纯化的RanBP5-like重组蛋白。纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔后制备得到多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:16000以上。利用该抗体通过Wester.blotting技术检测家蚕各个发育阶段和五龄蚕各个组织中RanBP5-like蛋白的表达和分布,结果显示蛋白表达水平在蛹和精巢中的表达量最高,此外我们还利用荧光定量PCR的方法,对家蚕各个时期及五龄蚕各个组织中RanBP5-like蛋白mRNA的量进行分析发现结果和Wester.blotting的结果相符。利用抗体免疫荧光标记技术我们对该蛋白在家蚕Bm5细胞中进行定位,观察到红色荧光主要分布在细胞质中。