苯丙氨酸脱氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC:4.3.1.5)通过非氧化脱氨形式将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和少量氨;同时,在一定条件下可催化逆向反应。与其他生物来源的PAL相比,鱼腥藻(Anabaena variabilis)来源的PAL(AvPAL)稳定性较高,且在体内引起的抗原性低,最具有医药应用前景;同时,由于AvPAL底物谱宽,其在合成绿色非天然手性氨基酸方面也有着较大的前景。然而,AvPAL的最适反应pH为8.5(用于人体注射治疗剂时,血浆环境pH约为7.3-7.4),酶活相对低以及体内稳定性差,限制了该酶的应用。本论文通过改造AvPAL的Tyr78-loop提高了酶活;另外,通过突变活性中心附近的表面氨基酸改变电荷分布,使AvPAL的最适反应pH往酸性范围偏移了1-1.5个单位;并进一步通过硅胶-凝胶方法包埋AvPAL,提高了酶对极端酸性条件以及胰蛋白酶的耐受性。具体研究内容如下:(1)Tyr-loop(包含质子受体Tyr)对MIO依赖型酶的酶活性质起着相当重要的作用,增加该类酶的Tyr-loop柔性可以增加其脱氨酶活。为了提高AvPAL的酶活,通过与真核生物来源的PAL Tyr-loop序列的同源比对,对AvPAL该柔性区域进行了突变改造,获得了一系列的突变体。比酶活研究表明,突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37℃,pH 8.5下比酶活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。(2)根据在线软件GETAREA和AvPAL的晶体结构,选择了质子受体Tyr78附近的表面氨基酸:Asn69,Glu72,Glu75,Asn89以及Val90。通过在Tyr78附近移除负电荷或引入正电荷,酶的最适反应pH成功偏移。其中E75A,E75L和E75Q突变体的最适反应pH均由pH 8.5移至pH 7.5,在相应条件下比酶活比原酶分别高出35%,30%和24%。同时,E75L和E75Q在70℃下的半衰期分别由130 min延长至190 min和180 min。另外,当用pH 7.5的缓冲液处理时,WT在30 min内几乎完全失活,而E75L经过3 h的处理后仍保留了原始酶活的55%;经300μg/m L的胰蛋白酶溶液处理60 min后,WT仅保留了44%的酶活,而E75L即使经过3 h的处理还保留了70%以上的原始酶活。(3)口服药物治疗苯丙酮尿症因其方便性备受关注,游离的PAL在肠胃的极端条件下稳定性差,经过硅溶胶-凝胶方法包埋的PAL稳定性显著提高,有望用于口服治疗。在pH 3.5的环境中,游离酶在30 min内几乎完全失活,而酶颗粒经过3 h后还能保留80%以上的原始酶活;在300μg/m L的胰蛋白酶溶液中,游离酶的半衰期为45 min左右,而酶颗粒经过3 h还能保留60%以上的酶活。突变酶颗粒对极端条件的耐受性则进一步提高,经pH 3.5的缓冲液和300μg/mL的胰蛋白酶溶液处理3 h后,E75Q分别保留了100%和90%的原始酶活。