论文部分内容阅读
硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx/TXN)是一种广泛存在于细胞内、大小约为12KD的蛋白,它含有二硫键活性中心Cys-Gly-Pro-Cys。Trx在细胞内信号转导以及氧化应激导致的细胞凋亡中都起着很重要的作用。Trx在肿瘤细胞中的表达量会异常增高,这会促进细胞增殖,使肿瘤细胞对抗肿瘤药物表现出耐药性。Trx第100位苏氨酸的磷酸化受到抑制或突变会导致肝癌细胞HepG2对顺铂和阿霉素的耐药性下降,但其作用机理目前尚不清楚。硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin Interacting Protein,TXNIP/TBP-2)是Trx的内源性抑制物,能与氧化型Trx结合抑制其活性,减少Trx与其他胞内物质结合,从而影响细胞内信号。在肿瘤细胞中TXNIP的表达量减少或缺失,导致对Trx的抑制作用减弱。Trx的磷酸化是否会影响Trx-TXNIP的结合能力,目前未见到相关报道,若Trx无法磷酸化会使Trx更多的与TXNIP结合,则Trx活性降低,这将会有助于抗癌药物发挥药效。为此进行了如下研究:1)构建了真核表达载体pEGFP-c1-6His-Trx以及pEGFP-c1-6His-mTrx,突变型的mTrx-1指的是Trx-1第100位苏氨酸发生了突变,变成了丙氨酸,从而无法磷酸化。通过瞬时转染将两种质粒分别转染进入Hela细胞中,成功表达出了含Trx-1的融合蛋白。2)通过摸索电穿孔转染条件中的电压、脉冲时间、质粒浓度、电击次数,用以确定最佳转染条件,使pEGFP-c1-6His-Trx以及pEGFP-c1-6His-mTrx能在Hela细胞中高效表达。3)研究转染了两种质粒的细胞总蛋白中Trx-1与TXNIP的含量以及相互作用能力的强弱。4)提取两种细胞核蛋白,将Trx-1作为目的蛋白通过免疫共沉淀,比较两种细胞在核内的Trx-1与TXNIP相互作用能力的变化。5)用一定浓度的H2O2刺激两种细胞并提取细胞核蛋白,比较核内Trx-1与TXNIP相互作用能力的变化。6)加入磷酸酶抑制剂U0126(MEK1/2抑制剂),抑制细胞内蛋白磷酸化,比较核内Trx-1与TXNIP相互作用能力的变化。以上实验可以得到以下结论:转染了pEGFP-c1-6His-Trx的野生型细胞与转染了pEGFP-c1-6His-mTrx的突变型细胞中,在细胞总蛋白中,还原型的Trx-1含量高于氧化型的Trx-1。TXNIP只与氧化态Trx-1结合,且氧化态Trx-1含量越高,结合的TXNIP越多。由于Trx-1的突变,导致Trx-1更多的以无活性的氧化态存在,且突变型中氧化态Trx-1与TXNIP的结合能力弱于野生型中Trx-1与TXNIP的结合能力。在野生型与突变型的核蛋白中,Trx-1的含量基本相同,而突变型中TXNIP的含量高于野生型。且突变型细胞核蛋白中氧化态Trx-1高于野生型。加入了H2O2后,野生型细胞核蛋白内还原形态的Trx-1多余突变型。由于磷酸化抑制剂的作用,野生型和突变型细胞核蛋白中Trx-1-TXNIP的相互作用区别不明显。