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研究背景:哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病,其发病过程涉及多种细胞及细胞组分,新近研究发现细胞外囊泡的一种形式——外泌体在哮喘的发病中起着重要作用。外泌体是一种细胞内多泡体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的膜性小囊泡,直径30-150nm,外泌体及其内部装载着的蛋白质、miRNA、mRNA、脂质、DNA片段等各类分子“货物”参与机体生理、病理等多种生物学过程。已有研究证实哮喘患者BALF中存在外泌体,且与其相关的蛋白质、脂质及miRNA均参与了哮喘的炎症反应、气道重塑等病理生理过程。在过敏原等刺激下,循环的树突状细胞、CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞组分及及细胞组分共同参与气道慢性炎症,有研究证实哮喘患者外周血树突状细胞可通过释放外泌体促进Th2分化。鉴于外泌体是细胞释放到细胞外参与细胞间通讯作用,蛋白质作为生理功能的执行者,我们推测哮喘患者循环中存在与健康人群不同的外泌体来源的蛋白质,参与哮喘发病机制,并且不同严重度的哮喘患者血清外泌体蛋白也可能存在表达差异。目前尚未见哮喘患者外周血外泌体蛋白组学研究报道。研究目的:本研究旨在探索哮喘患者与健康人群、重症哮喘与非重症哮喘患者血清外泌体蛋白表达情况,通过生物分析方法找出各个比较组间的差异表达蛋白及分析其生物学功能,以期挖掘外周循环中新型蛋白标志物,有望应用于支气管哮喘的临床诊断、病情严重度判断及指导治疗中。研究方法:收取健康对照(n=10)、非重症哮喘患者(n=5)、重症哮喘患者(n=5)外周血4ml/标本,离心分离血清,随后使用SEC体积排阻层析法提取血清外泌体,利用透射电镜及纳米微粒追踪检测(NTA)方法对外泌体进行鉴定。采用基于增加离子淌度的Times Tof Pro质谱仪器的4D LFQ方法,对血清外泌体样本进行蛋白组学析,使用Maxquant软件(v1.6.6.0)对数据进行检索、处理,筛选出具有统计学意义的差异表达蛋白,并利用GO、KEGG分类及富集等生信分析方法展示差异表达蛋白的功能及其所参与的关键通路。研究结果:1.哮喘组与健康对照组血清外泌体电镜下都表现为圆形或者类圆形类似“茶托样”的双层膜状结构,NTA检测结果提示哮喘组外泌体粒径浓度分布呈单峰状,直径约107nm,浓度为9.7X 109/L,健康对照组外泌体直径约153.5nm,浓度为 8.9×10/L。2.利用非标定量蛋白质组学技术在血清外泌体中鉴定700个蛋白,其中538个可定量蛋白。3.以差异表达量变化>1.5作为显著上调变化阈值,<1/1.5作为下调变化阈值,与健康对照组相比较,哮喘患者血清外泌体中共检测到44个蛋白表达上调,39个蛋白表达下调;与非重症哮喘患者比较,重症患者血清外泌体共检测到5个蛋白表达上调,10个蛋白表达下调;4.G0富集分析中,与健康对照组相比较,哮喘患者血清外泌体差异表达蛋白与刺激免疫应答、细胞迁移、调节炎症反应、膜攻击复合物形成等功能有关;重症哮喘和非重症哮喘组差异蛋白主要参与调节上皮细胞形成与分化、细胞对脂质的应答过程;5.和健康对照组相比,KEGG通路富集分析提示哮喘组上调蛋白主要参与“哮喘”、“PI3K-Akt信号旁路”,“NF-κB信号通路”、“Fc-ε RI信号通路”,特别是上调蛋白IGHV3-7、IGHV6-1同时参与调节上述通路;重症哮喘和非重症哮喘组差异蛋白如CES1则与药物代谢途径相关。研究结论:哮喘患者和健康人群外周血清外泌体蛋白表达存在差异,生物信息学分析提示差异蛋白多参与免疫、炎症反应,如IGHV3-7、IGHV6-1蛋白上调,可能通过调控“哮喘”、“PI3K-AKT信号通路”、“NF-κB信号通路”以及“Fc-ε RI信号通路”等参与哮喘的发病。重症哮喘和非重症哮喘组血清外泌体蛋白表达存在差异,上调蛋白CES1参与调控药物代谢途径。