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[目的] 通过采用分子生物学等技术和方法,在体内外观察异丙酚后处理对缺血再灌注和缺氧复氧诱导的细胞自噬及其相关基因Beclin-1表达的影响,分析和验证microRNA-30b对Beclin-1的靶向调节关系,阐明异丙酚通过microRNA-30b靶向调节Beclin-1抑制缺血再灌注诱导的过度细胞自噬,为揭示异丙酚后处理的心肌保护作用机理提供新依据。 [方法] 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在无糖无血清环境下缺氧12h,更换高糖10%胎牛血清复氧4h,建立缺氧复氧的细胞模型,加入不同浓度的异丙酚(25、50、100、150μmol/L),将实验分为正常细胞组(NC);缺氧复氧损伤组(H/R);异丙酚后处理缺氧复氧损伤组(H/R+P-PostC)。实时定量PCR检测miR-30b的表达,Western Blot检测Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达。择期体外循环下瓣膜置换术患者40例,随机分为七氟烷组和异丙酚后处理组,每组20例。七氟醚组:麻醉维持全程吸入0.5%-2%七氟醚;异丙酚IPostC组:主动脉开放前持续吸入0.5%-2%七氟醚,主动脉开放即刻靶控输注异丙酚,血浆靶浓度为1ug/ml,同时下调七氟醚吸入浓度,维持BIS值40-60范围内至手术结束。术中必要时追加哌库溴铵维持肌松。分别于上腔静脉插管时(T1)、停跳后15min(T2)、复跳后10min(T3)采集标本,实时定量PCR检测两组患者各个时间点miR-30b的水平,Western Blot检测Beclin-1的水平。 生物信息学技术分析miR-30b与Beclin-13 UTR的结合位点。细胞分组:①blank组:不转染miRNA序列;②miR-30b组:转染miR-30b mimic;③miR-30binhibitor组:转染miR-30b inhibitor;④NC组:转染miRNA无关序列;⑤NCinhibitor组:转染无关序列miRNA inhibitor。荧光素酶验证Beclin-1是否为miR-30b的靶向调节蛋白。将HUVECs分为5组:①blank组;②miR-30b组:转染miR-30b mimic;③miR-30b control组:转染miR-30bcontrol;④miR-30binhibitor组:转染miR-30b inhibitor;⑤miR-30b inhibitor control组:转染miR-30binhibitor control。Western Blot检测Beclin-1水平。 将HUVECs分为7组:①正常细胞组(NC):未经任何处理;②缺氧复氧组(H/R):无糖无血清培养基缺氧12h后换高糖10%血清培养基复氧4h;③缺氧复氧+100umol/L异丙酚后处理组:缺氧同上述操作,复氧同时加入100μnol/L异丙酚;④缺氧复氧+miR-30b组:转染miR-30b培养24h,无糖无血清培养基缺氧12h后换高糖10%血清培养基复氧4h;⑤缺氧复氧+miR-30b control组转染miR-30b control培养24h,缺氧复氧同④组;⑥缺氧复氧+miR-30b: inhibitor组(HR+miR-30b IN):转染miR-30b inhibitor培养24h,缺氧复氧同④组;⑦缺氧复氧+miR-30b inhibitor control组:转染miR-30b inhibitor control培养24h;缺氧复氧同④组。自噬:通过Westem Blot检测各组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62水平;免疫荧光观察各组LC3的数量。凋亡:CCK-8试剂检测各组细胞活力;Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2。 [结果] 1.异丙酚上调miR-30b抑制Beclin-1、LC3Ⅱ等的表达:离体实验:100umol/L异丙酚后处理组与其他组比,上调miR-30b,抑制Beclin-1、LC3-Ⅱ水平且呈剂量依赖性(25-100μmol/L)(P<0.05)。临床实验:异丙酚后处理组与七氟醚组在再灌注期比较及异丙酚组内再灌注期与缺血期比较,miR-30b上调而抑制Beclin-1表达。 2.Beclin-1是microRNA-30b的直接靶向调节蛋白:生物信息学软件显示了miR-30b与Beclin-1的结合位点。荧光素酶实验验证miR-30b组荧光素低于空白组,而miR-30b inhibitor组能抑制其降低(P<0.05)。与正常细胞比较,过表达miR-30b可降低Beclin-1水平,miR-30b inhibitor则增加Beclin-1。 3.异丙酚通过上调miR-30b抑制缺氧复氧诱导的过度自噬和凋亡:自噬:与H/R组比较,100umol/L异丙酚后处理组和miR-30b+HR组降低了Beclin-1、LC3Ⅱ水平,增加p62的表达,并且免疫荧光中观察到LC3自噬点减少;而miR-30binhibitor+H/R组增加了Beclin-1、LC3Ⅱ水平,减低p62的表达,LC3自噬点增加(P<0.05)。凋亡:与H/R组比较,100μmol/L异丙酚组和miR-30b+HR组增加Bcl-2、降低了Bax的水平,并且细胞活力明显恢复,而miR-30b inhibitor+HR组降低Bcl-2、增高Bax水平,降低细胞活力。 [结论] 1.Beclin-1是microRNA-30b的直接靶向调节蛋白。 2.异丙酚通过上调miR-30b降低自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达从而抑制缺氧复氧诱导的过度自噬及凋亡。此外miR-30b可部分模拟异丙酚减轻缺氧复氧诱导的内皮细胞损伤。