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本论文是在上届论文确定的酶解条件基础之上,将大豆蛋白酶解液进行预处理,上样后通过单因素试验确定凝胶过滤色谱最适分离条件,绘制分子量标准曲线,并对分离液进行血管紧张素转化酶(Angioensin Converting Enzyme,简称ACE)体外抑制实验,最终确定分离出的抑制活性高的组分的分子量范围,完成降血压肽的分离过程。在凝胶分离上采用SephadexG-25进行分组分离和SephadexG-15进行成分分离连续顺次性的分离方法。本论文还进行了自发性高血压症大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,简称SHR)动物实验,对酶解产物的稳定性进行了研究。研究结果表明:
确定了凝胶过滤色谱的最适分离条件。在分组分离中,SephadexG-25 Medium分离的最适条件为:上样量5mL,酶解液2倍浓缩,洗脱流速2mL/6min,单管收集量2mL。后改用SephadexG-25 Super fine分组分离,其最适分离条件为:上样量5mL,酶解液2倍浓缩,洗脱流速2mL/7min,单管收集量2mL。进行组分分离,使用Sephadex G-15分离的最适分离条件为:上样量2mL,分组分离样4倍浓缩,洗脱流速2mL/8min,单管收集量2mL。
绘制分子量标准曲线并进行体外ACE抑制实验。SephadexG-25 Medium分组分离的洗脱曲线将组分分成6组,效果最好组别的ACE抑制率为86.70%,分子量范围为1440~780Da。之后改用SephadexG-25 Super fine分组分离,对应的最好组别ACE抑制率为92.78%,分子量范围为1440~710Da,分离曲线得到很大程度的改善。使用SephadexG-15组分分离,分成6个洗脱峰确定抑制效果最好的为第3个洗脱峰,ACE抑制率为71.04%,分子量范围为1060~790。分析其成分为8~10个左右氨基酸残基的多肽。通过管数计算酶解产物的分离最终产率为4.55%。
通过分离实验和体外ACE抑制实验发现,降血压肽并不是集中在某一个肽段,其分子量分布在一个很广的范围内均有ACE抑制活性,只是抑制率高低不同。
SHR动物实验表明:木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白1h的水解物的降血压活性最高,SHR灌胃2h后血压下降为18.4mmHg。酶解产物的稳定性研究表明:样品分别采用常温和高温杀菌处理,SHR灌胃2h后血压分别下降了13.5mmHg和10.2mmHg;对样品调酸后杀菌与不杀菌,SHR灌胃2h后血压分别下降1~3mmHg和18mmHg左右。