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背景与目的:ras基因最初在Harvery和Kirsten鼠肉瘤病毒(Ki-MSV和Ha-MSV)的子代病毒中被发现,这种子代病毒基因中发现含有来源于宿主细胞基因组的新基因序列,人们将该宿主细胞基因称为ras基因。此后,人们陆续在膀胱癌(H-ras)、肺癌(K-ras)及神经母细胞瘤(N-ras)中发现类似的基因。野生型的ras基因具有抑制肿瘤功能,但是可以通过基因点突变、大量表达、基因插入及转位等被激活,活化的ras基因通过转录翻译异常的Ras蛋白参与到人类肿瘤的发生发展的过程中来。Ras蛋白作为MAPK信号通路的重要转导分子,在鸟苷酸置换因子参与下,无活性的Ras-GDP广泛转变为有活性的Ras-GTP,以三磷酸鸟苷依赖性方式与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C-Raf相互作用,激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。C-Raf为Ras信号进入MAPK通路的枢纽,承担了MAPK激酶的激酶功能。活化的C-Raf选择性地磷酸化并激活MAPK激酶,一部分胞质中激活的MAPK激酶进入细胞核,通过核转录因子的磷酸化作用来调节基因表达。此外,Ras蛋白还可以异常激活PI3K/AKT信号转导通路和Ral鸟苷酸交换因子(GEF)/Ral通路等。在胶质瘤中,上游生长因子EGFR, PDGFR等的活化可以使Ras蛋白的活性增强,在人类以及鼠类胶质瘤模型中已经证实异常活化的Ras蛋白可以导致胶质瘤的形成,近年来诸多研究表明突变活化的Ras蛋白与胶质瘤的发生发展密切相关。本研究拟利用生物信息学方法采集在肿瘤发生发展中与Ras发挥作用相关的基因,并整合成为Ras相关基因间的关系网络,筛选Ras相关信号通路中的枢纽基因(Hub基因)。通过检测并分析不同病理级别胶质瘤组织中Ras蛋白及其相关Hub基因的表达情况,体外试验中探讨该基因对胶质瘤细胞生物学特征的影响。阐述Ras蛋白在胶质瘤发生发展中的作用机制,为该基因作为胶质瘤诊断和治疗靶点提供依据。研究方法:1.利用生物信息学方法(NLP分析、GO分析、基因网路及Pathway分析)采集肿瘤发生发展中与Ras发挥作用相关的基因,并整合Ras相关基因间的关系网络,筛选Ras相关信号通路中的枢纽基因(Hub基因)。2.应用免疫组化的方法检测正常脑组织及各级别胶质瘤组织中Ras蛋白阳性表达率。3. RT-PCR方法检测Ras和Hub mRNA在正常脑组织及各级别胶质瘤组织中的表达水平。4.选取对数生长期的U87和U251细胞,使用小分子Ras抑制剂(法尼基硫代水杨酸,FTS)降低Ras蛋白活性,应用MTT实验评价特异性抑制Ras活性后U87和U251细胞细胞增殖,并计算出Ras抑制剂的50%存活率浓度。5.流式细胞术检测FTS处理胶质瘤细胞后,对U87和U251细胞周期及凋亡的影响。6. Western Blot检测特异性抑制Ras活性后MAPK通路中相关Hub基因的表达情况。研究结果:1.通过生物信息学分析得到Ras通路相关基因,将所有的Ras相关基因作为一个整体,按照他们的生物学功能分为三大类,①生物学进程;②细胞组成;③分子功能,并绘制Ras相关基因间的网络图谱,筛选出Ras相关信号通路中的枢纽基因(Hub基因—PIK3CA、MDM2、CCND1、EGFR、JUN、MYC、VEGFA、ERK1/2)。2.胶质瘤组织中Ras蛋白阳性表达率及相关Hub基因mRNA表达水平随胶质瘤病理分级增高而增高。3. U87和U251胶质瘤细胞中使用FTS有效抑制Ras蛋白活性后,胶质瘤细胞的存活率随FTS的浓度升高而降低,并且在50%存活率浓度下胶质瘤细胞的存活率随时间的推移明显下降。4.胶质瘤细胞中Ras蛋白活性被抑制后,能够诱导细胞周期阻滞在G1/G0期,胶质瘤细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡明显增加。5. FTS作用于胶质瘤细胞,Ras蛋白活性被抑制后,Ras及相关信号通路中的Hub基因蛋白表达均随之降低。结论:1.基因/蛋白质相互作用网络提供全面了解细胞生物学过程的关键信息,我们通过挖掘MEDLINE文摘建立Ras相关生物学网络,生物信息学分析显示并确定与肿瘤发生发展相关的信号通路是MAPK。最终确定PIK3CA、MDM2、CCND1、EGFR、JUN、MYC、VEGFA、ERK1和ERK2为Ras相关基因网络中的关键枢纽基因。2. Ras及相关信号通路Hub基因mRNA在高级别胶质瘤中呈高表达。 FTS处理后,降低Ras蛋白的活性,暨而抑制胶质瘤细胞生长,诱导胶质瘤细胞阻滞在G1/G0期,促使细胞凋亡明显增加,其相关信号通路中的Hub基因表达也随之下降。综上,我们认为通过抑制Ras活性可以抑制胶质瘤细胞的生长,诱导胶质瘤细胞死亡, FTS可作为胶质瘤治疗的潜在手段,具有重要临床应用价值。