胱抑素-C在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制的研究

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目的:观察胱抑素-C(Cystatin-C,Cys-C)对小鼠脑缺血再灌注(Ischemia Reperfusion,I/R)中血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的破坏是否具有保护作用;研究Cys-C与小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)之间的相互关系;探讨Cys-C在I/R损伤中的保护机制,为I/R损伤的防治和新型临床药物的开发提供理论基础。方法:体内实验选用雄性的ICR小鼠(23-28g),随机分为4组:假手术(Sham)组、假手术+预处理(Sham+Cys-C)组、缺血再灌注(I/R)组、预处理后缺血再灌注(I/R+Cys-C)组,用立体定位法向小鼠侧脑室微量注射小鼠重组Cys-C蛋白,制作大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型再灌注1天后,小鼠血脑屏障的通透性采用尾静脉注射Evans Blue法检测,脑组织中基质金属蛋白酶MMP-9的活性则采用明胶酶谱法测定,制作MCAO模型,在I/R 1天后取脑切片用免疫组织化学染色法评估Cys-C及Cav-1在小鼠脑中表达的定位情况,通过免疫荧光双染色法测定Cys-C及Cav-1的细胞分布,采用免疫共沉淀法检测Cys-C及Cav-1的相互作用关系。体外实验选用小鼠脑微血管内皮细胞(bEND3),通过质粒转染,缺氧缺糖(OGD)后复氧模拟缺血再灌注损伤,观察胱抑素C过表达对细胞中Cav-1和紧密连接闭合蛋白occludin表达的影响。结果:在体内实验中,与Sham组相比预处理组I/R损伤后血脑屏障的通透性及MMP-9活性均低;小鼠缺血再灌注后缺血侧脑半球皮质区Cys-C和Cav-1的表达量明显高于非缺血侧;Cys-C与Cav-1在细胞核周存在染色重叠即共表达关系;免疫共沉淀显示Cys-C与Cav-1蛋白存在相互作用。在体外实验中,Cys-C过表达的bEnd3细胞在OGD后上调Cav-1及occludin的表达。结论:1.Cys-C预处理在小鼠脑I/R损伤中对血脑屏障的完整性能够发挥一定的保护作用,并能通过减少MMP-9的活性,减少血脑屏障的破坏。2.Cys-C和Cav-1在小鼠脑组织细胞中具有共定位关系并可能存在相互作用。3.Cys-C在小鼠脑急性I/R损伤中通过上调Cav-1的表达水平,进而上调occludin的表达,在维持血脑屏障完整性方面起到显著的神经保护作用。
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