粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ECU1O10是本实验室针对心血管药物地尔硫卓手性中间体—(-)对甲氧基苯基缩水甘油酸甲酯[㈠-MPGM]的制备而筛选的专利菌株(保藏号：CGMCC No.1219)。粘质沙雷氏菌ECU1010的拆分性能是由于其胞外脂肪酶的存在。　　 本文在实验室前期工作的基础上，对这一重要的工业生物催化用酶和重要的酶促反应过程做了进一步深入研究。用传统诱变选育的方法对菌种进行改造，使脂肪酶产量得到显著提高；优化了培养基组分，降低了发酵成本；考察了该脂肪酶的酶学特性和工业应用潜力；针对(±)-MPGM的酶促拆分这一重要生物催化反应过程，研究了该脂肪酶的固定化和在搅拌釜反应器(STR)两相体系中的酯水解反应；初步探索了定向进化改造该脂肪酶的实验方法。为实现脂肪酶制剂的规模制备，在500L发酵罐中进行沙雷氏菌的扩大培养，通过对发酵液进行不同孔径膜的超滤浓缩，然后添加乳糖保护剂并冷冻干燥，最终制得粗酶粉80g，比酶活为325U(pNPA)/g。　　 首先，通过紫外诱变选育，得到脂肪酶高产菌株粘质沙雷氏菌变种—Serratiamarcescens ECU1010 var.UV01，其产脂肪酶的能力提高2.3倍，并且几乎不产严重妨碍脂肪酶纯化的灵菌红素(Prodigisoin)。基于工业生产成本的考虑，对培养基的碳源、氮源及诱导剂Tween-80进行了重新优化，确定用廉价的玉米浆代替昂贵的牛肉膏，培养基优化后生产相同单位脂肪酶的成本降低了85％。Tween-80是脂肪酶发酵培养基的重要组成，通过实验证明Tween-80能够作为碳源支持菌体生长，并且Tween-80的高降解率表明粘质沙雷氏菌可作为非离子表面活性剂的降解菌，在污水处理方面可能有应用潜力。　　 之后，对粘质沙雷氏菌ECU1O1O的发酵液(1.5 L)通过5步分离纯化，得到了电泳纯的脂肪酶蛋白，纯化倍数为5.5倍，冻干保存1Omg(蛋白量)。对该酶的性质研究结果表明，该脂肪酶为亚基分子量65kDa的二聚体，最适温度为45℃，最适pH为8.0。在不同碳链长度的对硝基苯酚羧酸酯中，该酶对肉豆蔻酸酯(C14)的水解活性最高。该脂肪酶可以被表面活性剂阿拉伯树胶(Gum arabic)、聚乙烯醇(PVA)和Pg350me激活。在多种有机溶剂，特别是与水互溶的极性有机溶剂中该酶表现出高稳定性，提示其可用于多种有机溶剂体系中的水解或合成反应，是一种有机溶剂高耐受性的脂肪酶。在多种药物关键中间体的催化拆分反应中，该酶不仅可以高对映选择性地催化拆分地尔硫卓关键中间体—(±)-MPGM，其对映选择率E＞100，还可以高对映选择性地催化拆分萘普生甲酯(E=85)、烯丙醇酮醋酸酯(E＞100)、缩水甘油丁酸酷(E＞100)，说明该酶在手性药物和手性农药砌块的生物拆分领域中具有广泛的应用前景。需要特别指出的是，该酶对(R)-缩水甘油丁酸酯表现出优良的对映选择性，这与大多数脂肪酶优先水解(S)-缩水甘油丁酸酯的选择性恰好相反。　　 为便于脂肪酶在生产中的使用，酶的固定化是重要途径之一。通过8种载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶的效果和成本比较，发现壳聚糖、硅藻土(Celite545)和离子交换剂DEAE-cellulose是较好的固定化载体，其中壳聚糖固定化酶的固定化成本最低为1.4 CNY/KU。通过考察游离酶和三种固定化酶的热稳定性、pH稳定性及三种固定化酶的操作稳定性，发现壳聚糖固定化酶的稳定性要优于其他两种载体固定化酶。壳聚糖固定化酶、硅藻土固定化酶和DEAE-cellulose固定化酶在50℃保温6 h后分别残留105％，58％，12％的活力，而游离酶损失了94％的活力。壳聚糖固定化酶在各种测试pH条件下也比其他固定化酶有更高的pH稳定性。壳聚糖固定化酶的半衰期为22.5 h，而DEAE-cellulose固定化酶和硅藻土固定化酶的半衰期分别为18 h和15.5 h。并且壳聚糖固定化酶在酶活降为一半时，可连续使用10批。实验结果提示壳聚糖是廉价易得、适于工业化生产的固定化载体。另一个重要的实验结果是，在不同有机溶剂体系中对(±)-MPGM进行酶促拆分反应时，在异丙醚-水两相体系中(±)-MPGM的拆分反应速率分别是在甲苯-水、叔丁基醚-水两相体系中的6倍和3倍。利用壳聚糖固定化酶在2 L搅拌釜反应器(BSTR、CSTR)中，对(±)-MPGM(100 mM)进行拆分反应。通过在间歇搅拌罐反应器(BSTR)中进行21批酶促拆分反应，获得光学纯(-)-MPGM186g，总收率为44.3％，时空产率(STY)为4.54 g·h-1·L-1(-)-MPGM;而通过在连续搅拌罐反应器(CSTR)中进行酶促拆分反应获得光学纯(-)-MPGM10.5 g，总收率仅为29.3％，时空产率(STY)为0.84 g·h-1·L-1(-)-MPGM。结果表明BSTR是适宜的反应器形式。