研究背景中国是食管鳞状细胞癌高发国家,据估计,我国每年约有25万例新发食管癌病例。由于该病起病隐匿,早期一般没有明显的自觉症状,因此确诊时多数患者都已发展至中期或晚期。对于早期的食管癌患者,目前临床上主要采用以手术为主的根治性治疗方法,而对于那些已发生远处转移等情况的不适宜采取手术治疗的中晚期患者,则首推以放化疗为主的综合治疗。目前胸中段食管鳞癌的最主要治疗措施依然是外科手术,但手术的总体疗效仍欠佳,据文献报道,食管鳞癌的5年总的生存率仅为30%左右,约一半以上的患者在手术后2年左右出现肿瘤复发,其中局部区域复发最常见,以纵隔、锁骨上、及颈部淋巴结转移为主。尽管近年来食管癌的治疗技术已经有了较大的进步,但食管癌恶性程度高,疾病进展迅速,易发生复发和转移,患者的总体预后仍不容乐观。所以研究食管鳞癌转移复发的分子生物学机制,对指导食管鳞癌患者选择合适的治疗方案和改善预后具有非常重要的临床价值。环氧合酶(cyclooxygenase, COX),亦可称之为前列腺素过氧化物合成酶,能调节前列腺素的合成,在前列腺素(PG)合成过程中起着至关重要的作用,在其诱导下,花生四烯酸将被转化成类前列腺素(如血栓素等),从而能调节机体的生理代谢以及病理代谢过程。现有的实验结果证实,细胞中环氧合酶主要有COX-1和COX-2两种编码基因。其中,在正常细胞中可检测到COX-1基因表达的COX-1,其主要作用是辅助人体正常生理功能的维持。而COX-2则绝少在正常组织细胞中表达,只有在异常的内外环境的刺激下才被诱导性表达。在正常的生理状态下,仅仅在脑组织和肾组织中可探及少量的COX-2蛋白。近些年年的研究证实,在人类许多癌前病变和恶性肿瘤中,COX-2均呈现高表达,而且对肿瘤血管生成、细胞周期调控以及机体免疫功能调节均有不同程度的影响,因而在恶性肿瘤的发生发展过程中起到非常重要的作用。目前,国内外对环氧合酶与食管鳞状细胞癌生物学行为的研究仍不多见。本课题应用免疫组化法以及Western blot等技术检测环氧合酶COX-2在食管鳞状细胞癌组织以及正常食管粘膜组织中的表达情况,并结合入组患者的临床病理资料及完整的随访资料,意在探讨COX-2表达高低与食管鳞癌患者预后的关系,以资证明是否可将COX-2表达高低作为判断食管鳞癌患者预后的可靠指标。与此同时,我们尝试通过RNA沉默技术,阻断食管鳞癌Ecal09细胞系COX-2的表达,检测COX-2表达被抑制前后食管鳞癌细胞的增殖与侵袭能力,以求明确COX-2与食管鳞癌细胞生物学行为之间的关系,以此为理论基础,进一步探讨COX-2作为食管鳞癌靶向治疗靶点的可能性。第一部分 COX-2在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌患者临床特征之间的相关性研究目的1.检测食管鳞状细胞癌组织和正常食管粘膜组织中COX-2的表达情况2.统计分析COX-2的表达情况与食管鳞状细胞癌患者临床病理学特点之间的关系方法本实验入组患者共118例,均为在2006年10月～2009年9月间在山东大学附属山东省立医院胸外科接受外科手术的胸中段食管癌患者。实验中,成对留取患者的病理标本,包括食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常食管粘膜组织。本组病例无手术前放/化疗者。手术方式为经右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸顶吻合术(Ivor-Lewis手术)。应用免疫组化法和Western blot法检测每份标本中COX-2的表达情况,同时结合所有入组患者的临床病理学资料进行回顾性分析。应用SPSS 19.0软件进行数据分析。其中,运用均数±标准差(x±s)的方式来表示计量资料,进行两组均数的比较时,若方差齐,则运用独立样本t检验,若方差不齐,则运用t’检验。应用卡方检验分析COX-2的表达情况与入组患者临床病理学特征之间的关系。P<0.05时,认为具有统计学差异。结果在免疫组化法中,细胞浆或细胞膜被染成棕色或黄色颗粒被认为是COX-2表达阳性。在入组的所有患者的食管鳞状细胞癌标本中,有88例(74.6%)入组患者的食管鳞癌标本中可发现COX-2表达阳性。卡方检验证实,癌旁正常的食管黏膜组织中的COX-2的表达水平明显低于癌组织中COX-2的表达水平(P<0.001)。118例患者肿瘤组织中Ⅰ+Ⅱ期和III+IV期患者COX-2阳性表达率分别为54.3%和83.1%,差异有统计学意义(x2=10.805, P=0.001); T1、T2和T3+T4患者COX-2阳性表达率分别为50.0%、60.0%和82.5%,COX-2表达率差异有统计学意义(x 2=8.559,P=0.014)。有、无淋巴结转移患者COX-2表达率分别为80.7%和56.7%,两组COX-2表达率差异有统计学意义(x 2=6.805,P=0.009)。Western blot检测结果显示,COX-2的表达水平与肿瘤浸润深度(T分期)呈明显正相关(P<0.05)。通过卡方检验可以看出,COX-2表达情况与病变浸润深度(P=0.014)、病变分化程度(P=0.002)、淋巴结转移情况(P=0.009)及pTNM分期(P=0.001)显著相关,而与年龄、性别等其他临床病理学特点并无明显相关性。简单的说,肿瘤分化程度越差,浸润深度越深,淋巴结转移越多,pTNM分期越晚,则COX-2阳性表达率越高。在本实验中,66例pT3+T4期患者食管鳞状细胞癌标本中可检测到COX-2阳性表达；43例(89.5%)低分化的食管鳞状细胞癌患者标本中可检测到COX-2阳性表达；,69例(83.1%)术后病理分期为Ⅲ期和Ⅳ期的患者的食管鳞状细胞癌标本中可检测到COX-2阳性表达。结论：1.在食管鳞状细胞癌组织中,COX-2表达显著增高。2.COX-2的高表达与食管鳞状细胞癌病变浸润深度、病变分化程度、淋巴结转移情况及其pTNM分期呈显著正相关。3.COX-2的高表达与食管鳞状细胞癌的发生发展以及侵袭转移潜在相关。第二部分 COX-2与食管鳞状细胞癌患者预后的相关性分析目的：探究COX-2的表达与经手术完整切除的胸中段食管鳞状细胞癌患者预后之间的关系。方法：本实验入组患者共118例,均为在2006年10月～2009年9月间在山东大学附属山东省立医院胸外科接受外科手术的胸中段食管癌患者。通过免疫组化法检测上述患者食管鳞状细胞癌组织中COX-2的表达情况,并结合完整的随访资料,建立数据库。通过SPSS 19.0软件进行数据分析,运用Kaplan-Meier法及Cox多因素回归分析计算患者生存率并检测影响生存率的预后因素。当P值<0.05时,认为具有统计学意义。结果：有、无COX-2表达患者的5年生存率为10.22%和50.0%,两组差异有统计学意义(P<0.01)。T2患者中,有、无COX-2表达者5年生存率分别为16.7%和66.7%,两组差异有统计学意义(P=0.005)；T3+T4患者中,有、无COX-2表达组的5年生存率分别为4.5%和21.4%,两组差异有统计学意义(P=0.029)。pN0患者中,有、无COX-2表达患者5年生存率分别为47.1%和92.3%,两组差异有统计学意义(P=0.009); pN1+N2患者中,有、无COX-2表达组5年生存率分别为1.4%和17.6%,两组差异有统计学意义(P=0.004)。本实验中ESCC患者总体的3年生存率是36.4%,5年生存率20.3%。中位生存时间是33.0个月(95%可信区间：28.6-49.4个月)。ESCC组织中未查到COX-2高表达的患者,其3年和5年生存率分别是73.3%和50%；而ESCC组织中有COX-2高表达的患者,其3年和5年生存率分别是23.9%和10.2%,中位生存时间为22.0个月(95%可信区间：18.9-32.1个月)。单因素分析表明,COX-2表达水平的高低是ESCC患者至关重要的预后因素(P=0.004)。ESCC组织中有无COX-2的高表达,其5年生存率有明显差异,统计分析显示结果具有统计学意义。通过单因素分析,我们发现预后因素还包括肿瘤分化程度和pTNM分期。分化程度越低,则5年生存率越差,低分化的ESCC患者,5年生存率仅为2.1%,与此同时,高、中分化ESCC患者的5年生存率则为32.9%,两组差异具有统计学意义(P=0.001)。pTNM分期越晚,则患者5年生存率越低。Ⅰ+Ⅱ期患者5年生存率为60.0%,而Ⅲ+Ⅳ期患者5年生存率则降至1.2%,两组差异具有统计学意义(P<0.01)。同时,分析结果还显示,年龄(Age)、性别(Gender)等因素与患者术后5年生存率并无显著关联。通过COX多因素回归分析,我们发现,肿瘤分化程度(P=0.001)、TNM分期(P=0.001)和COX-2表达水平(P=0.004)均是判断胸中段食管鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素。结论：1.肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、pTNM分期及COX-2表达水平与ESCC患者术后5年生存率有明显关联。2.COX-2表达水平是ESCC患者术后5年生存率的独立危险因素。3.COX-2高表达的胸中段食管鳞癌患者预后不良,提示COX-2有成为预测食管鳞癌患者术后转移复发的潜在基因的可能。第三部分 COX-2siRNA体外阻断COX-2表达对食管鳞癌Eca1 09细胞生物学行为影响的研究目的：通过RNA沉默技术,以COX-2 siRNA体外阻断食管鳞癌Eca109细胞系COX-2的表达,检测COX-2表达被抑制前后食管鳞癌细胞的增殖与侵袭能力的差异。方法：具体步骤如下：1.应用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测食管鳞癌Eca109细胞系中COX-2的表达情况。2.通过慢病毒携带COX-2 siRNA转染食管鳞癌Eca109细胞系,抑制COX-2的表达,构建稳定的经RT-PCR和Western blot检验抑制COX-2表达的Eca109细胞系。3.应用MTT法比较COX-2表达被抑制前后Eca109细胞的增殖情况。4.通过Transwell侵袭实验比较COX-2表达被抑制前后Eca109细胞的侵袭能力。结果：1.经验证,食管鳞癌细胞系中存在COX-2高表达。2.本实验中,我们应用慢病毒携带COX-2 siRNA转染食管鳞癌Eca109细胞系,成功构建了经RT-PCR和Western blot检测COX-2稳定低表达的Eca109细胞系。3.实验结果显示,COX-2表达被抑制的食管鳞癌细胞的增殖和侵袭能力受到明显抑制。结论：COX-2明显影响食管鳞癌细胞的生物学行为,与食管鳞癌细胞的增殖及侵袭能力显著相关。