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[目的]
本研究拟通过体外培养肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)、设计并建立低氧培养细胞模型和不同低氧时间不同药物处理PASMCs,研究低氧对PASMCs增殖、腺苷A2b受体(A2bAR)表达变化及其激动剂对细胞增殖的影响,从而为腺苷类药物治疗HPH提供理论依据和指导。
[方法]
1.采用组织块贴壁法原代培养PASMCs,免疫组化法鉴定细胞。
2.用真空压缩袋制作低氧培养细胞的模拟模型装置,测定细胞增殖来验证该设计的可行性。
3.实验分组:首先设空白组、实验组和对照组,然后随机分为低氧组(Hypoxia,H组)和常氧组(Normal,N组),将H组和N组分别进行A2bAR非特异性激动剂(CV-1808)和A2bAR特异性拮抗剂(MRS1754)处理后在不同环境培养,时间点设为0h、6h、24h、48h、72h。
4.采用免疫荧光的方法,在激光共聚焦显微镜下观察低氧不同时间下A2bAR在PASMCs上的分布情况和表达量的变化,及PASMCs的形态变化。
5.用Cell Counting试剂盒(CCK-8法)检测低氧不同时间经不同药物处理的PASMCs的增殖变化情况。
[结果]
1.原代培养的PASMCs传代后稳定性好,纯度高可达99％以上,免疫组化鉴定α-actin呈强阳性表达。
2.激光共聚焦显微镜下观察到,低氧下PASMCs有从长梭过度到短梭形的趋势,未出现典型生长方式,不出现或迟于常氧培养细胞出现凋亡。
3.免疫荧光法检测到A2bAR在PASMCs胞膜、胞浆均有表达,胞膜表达稍多。低氧下A2bAR表达增加,具有时间依赖性,但是持续时间较短。
4.CCK-8法结果显示,低氧下细胞增殖明显高于常氧(P＜0.0001),低氧下CV-1808处理组可显著抑制细胞增殖(P＜0.0001)。
[结论]
1.低氧下PASMCs形态和生长方式改变,提示PASMCs是血管收缩和血管重构的重要基础。
2.低氧诱导PASMCs增殖,呈时间依赖性。
3.低氧致PASMCs膜上A2bAR表达增加,低氧下A2bAR激动剂显著抑制PASMCs增殖,提示A2bAR的表达变化在低氧致PASMCs增殖中起重要作用。