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目的:通过体外培养大鼠睾丸间质细胞(Leydig细胞),观察硫酸镍(NiSO4)致大鼠Leydig细胞活性氧(ROS)水平及睾酮合成酶mRNA和蛋白表达水平的变化,探讨ROS在镍致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中的作用。方法:(1)采用0.25%胶原酶消化、Percoll连续梯度离心法和体外贴壁培养提取和纯化Leydig细胞,并通过3β-HSD(3β-羟类固醇脱氢酶)对纯化后的细胞进行纯度鉴定。(2)细胞处理取处于对数生长期的大鼠Leydig细胞,给予不同浓度(0、250、500和1000μmol/L)NiSO4及1 IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG)分别处理0、6、12和24 h;干预实验细胞处理取对数生长期Leydig细胞,分别经活性氧抑制剂NAC和TEMPO提前干预1 h后,再行1000μmol/L NiSO4处理24 h。(3)用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中睾酮浓度。(4)采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术分别检测Leydig细胞类固醇合成快速调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、类固醇17α-羟化酶(CYP17A1)、3β-HSD和17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)的mRNA和蛋白表达水平。(5)采用DCFH-DA探针法检测大鼠Leydig细胞内ROS水平。结果:(1)3β-HSD染色法鉴定结果显示,Percoll纯化及细胞贴壁生长24h后,可得到纯度较高的Leydig细胞。(2)ELISA法检测结果显示:与0 h组比较,hCG+0μmol/L NiSO4处理Leydig细胞12 h和24 h后,培养液中睾酮浓度均明显升高(P<0.05)。与0μmol/L NiSO4组(对照组)比较,hCG+500μmol/L NiSO4处理Leydig细胞24 h,以及hCG+1000μmol/L NiSO4处理细胞12和24h后,细胞培养液中睾酮浓度均显著降低(P<0.05)。RT-qPCR结果显示:与对照组比较,500μmol/L NiSO4处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶CYP11A1和17β-HSD mRNA表达水平均下降(P<0.05)。与对照组比较,1000μmol/L NiSO4处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD mRNA表达水平均下降(P<0.05)。Western Blot结果显示:与对照组比较,1000μmol/L NiSO4处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD的蛋白表达水平均下降(P<0.05)。(3)DCFH-DA探针法检测结果显示:与对照组比较,1000μmol/L NiSO4处理Leydig细胞24 h(NiSO4组),荧光显微镜下可见细胞中ROS水平明显升高。与NiSO4组比较,经5 mmol/L NAC(NAC组)和1 mmol/L TEMPO(TEMPO组)干预后,Leydig细胞中ROS水平明显下降(P<0.05)。ELISA法检测结果显示:与对照组比较,hCG+1000μmol/L NiSO4处理细胞24 h后,细胞培养液中的睾酮浓度显著降低(P<0.05)。与NiSO4组比较,NAC组和TEMPO组Leydig细胞培养液中的睾酮浓度则显著升高(P<0.05)。RT-qPCR和Western Blot分析结果显示:与对照组比较,NiSO4组Leydig细胞睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与NiSO4组比较,NAC组细胞上述基因mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05),而TEMPO组除CYP17A1和17β-HSD外,其他蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。结论:NiSO4可致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍,这可能与其诱导Leydig细胞ROS大量生成有关。NiSO4可降低大鼠Leydig细胞睾酮分泌和下调睾酮合成酶相关基因和蛋白表达水平,且前述变化均可被活性氧抑制剂NAC和TEMPO所抑制,表明ROS在NiSO4诱导的大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中发挥重要作用。