目的:通过体外培养大鼠睾丸间质细胞（Leydig细胞）,观察硫酸镍（NiSO₄）致大鼠Leydig细胞活性氧（ROS）水平及睾酮合成酶mRNA和蛋白表达水平的变化,探讨ROS在镍致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中的作用。方法:（1）采用0.25%胶原酶消化、Percoll连续梯度离心法和体外贴壁培养提取和纯化Leydig细胞,并通过3β-HSD（3β-羟类固醇脱氢酶）对纯化后的细胞进行纯度鉴定。（2）细胞处理取处于对数生长期的大鼠Leydig细胞,给予不同浓度（0、250、500和1000μmol/L）NiSO₄及1 IU/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）分别处理0、6、12和24 h;干预实验细胞处理取对数生长期Leydig细胞,分别经活性氧抑制剂NAC和TEMPO提前干预1 h后,再行1000μmol/L NiSO₄处理24 h。（3）用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清液中睾酮浓度。（4）采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot技术分别检测Leydig细胞类固醇合成快速调节蛋白（StAR）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、类固醇17α-羟化酶（CYP17A1）、3β-HSD和17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD）的mRNA和蛋白表达水平。（5）采用DCFH-DA探针法检测大鼠Leydig细胞内ROS水平。结果:（1）3β-HSD染色法鉴定结果显示,Percoll纯化及细胞贴壁生长24h后,可得到纯度较高的Leydig细胞。（2）ELISA法检测结果显示:与0 h组比较,hCG+0μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞12 h和24 h后,培养液中睾酮浓度均明显升高（P<0.05）。与0μmol/L NiSO₄组（对照组）比较,hCG+500μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞24 h,以及hCG+1000μmol/L NiSO₄处理细胞12和24h后,细胞培养液中睾酮浓度均显著降低（P<0.05）。RT-qPCR结果显示:与对照组比较,500μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶CYP11A1和17β-HSD mRNA表达水平均下降（P<0.05）。与对照组比较,1000μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD mRNA表达水平均下降（P<0.05）。Western Blot结果显示:与对照组比较,1000μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞24 h后,睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD的蛋白表达水平均下降（P<0.05）。（3）DCFH-DA探针法检测结果显示:与对照组比较,1000μmol/L NiSO₄处理Leydig细胞24 h（NiSO₄组）,荧光显微镜下可见细胞中ROS水平明显升高。与NiSO₄组比较,经5 mmol/L NAC（NAC组）和1 mmol/L TEMPO（TEMPO组）干预后,Leydig细胞中ROS水平明显下降（P<0.05）。ELISA法检测结果显示:与对照组比较,hCG+1000μmol/L NiSO₄处理细胞24 h后,细胞培养液中的睾酮浓度显著降低（P<0.05）。与NiSO₄组比较,NAC组和TEMPO组Leydig细胞培养液中的睾酮浓度则显著升高（P<0.05）。RT-qPCR和Western Blot分析结果显示:与对照组比较,NiSO₄组Leydig细胞睾酮合成酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD的mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。与NiSO₄组比较,NAC组细胞上述基因mRNA和蛋白表达水平均升高（P<0.05）,而TEMPO组除CYP17A1和17β-HSD外,其他蛋白表达水平也显著升高（P<0.05）。结论:NiSO₄可致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍,这可能与其诱导Leydig细胞ROS大量生成有关。NiSO₄可降低大鼠Leydig细胞睾酮分泌和下调睾酮合成酶相关基因和蛋白表达水平,且前述变化均可被活性氧抑制剂NAC和TEMPO所抑制,表明ROS在NiSO₄诱导的大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中发挥重要作用。