CRISPR/Cas12a响应性传感器构建及其对柑橘黄龙病菌16S rDNA的检测研究

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黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由韧皮部限制性细菌Candidatus Liberibacter asiaticu感染引起,随亚洲柑橘木虱(Asian citrus psyllid,ACP)大范围传播的柑橘病害。目前,HLB已在全世界各柑橘主产区肆虐,尚无有效的防控和治疗手段。快速,精准的HLB早期诊断对控制果园病情意义重大。但是,黄龙病菌在柑橘植株内部分布极不均匀,含量极低。传统的以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)为基础的分子诊断技术,已无法满足对HLB感染早期诊断的高灵敏检测需求。新兴的规律成簇间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)纳米检测技术因高灵敏度、高特异性、信号可转化等特点在核酸检测、疾病诊断、即时检测等领域被广泛应用。基于此,本文设计了两个以DNA修饰纳米材料为基础的CRISPR/Cas12a(CRISPR-associated,Cas)响应性“货物负载”传感器,建立了高灵敏检测HLB的新方法,实现了对黄龙病菌的可视化检测。主要研究内容如下:1.CRISPR/Cas12a响应性介孔硅传感器构建及其对柑橘黄龙病菌16S rDNA的荧光检测当前,HLB的检测仍以PCR技术为主,假阳性高、早期诊断困难。因此,利用近年发展的CRISPR/Cas12a检测技术对解决HLB诊断中存在的问题意义重大。本章基于纳米技术和CRISPR/Cas12a核酸识别和信号转化能力,构建了响应性门控介孔硅(Mesoporous silica nanoparticle,MSN)材料用于HLB的高灵敏荧光检测。首先,制备了负载黑洞荧光淬灭剂(Black hole quencher,BHQ)和异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC),单链DNA(Single-stranded DNA,ss DNA)门锁封闭孔道的荧光探针FITC-BHQ@MSN-ss DNA;然后,以诱导扩增反应的方式扩增HLB16S rDNA寡核苷酸片段H1,产生可结合CRISPR相关RNA(CRISPR RNA,cr RNA)的产物DNA(Product DNA,H3)。最后利用H3激活的Cas12a反式裂解活性,裂解响应性FITC-BHQ@MSN-ss DNA探针表面吸附的ss DNA的门锁,释放FITC实现了HLB靶标的检测。对扩增酶含量、探针/Cas12a孵育时间优化后,达到了对HLB16S rDNA特异性检测的目的,检测范围为10-1000 pmol/L,检测限低至2.5 pmol/L,加标回收率为95%-102%。2.CRISPR/Cas12a响应性DNA凝胶传感器构建及其对柑橘黄龙病菌16S rDNA的可视化检测为了减小探针孵育时间,实现HLB快速和灵敏的检测,在第一章的基础上,本章依托DNA凝胶的核酸酶响应活性和纳米粒子巨大的“货物”搭载能力,设计了可响应CRISPR/Cas12反式裂解活性的DNA水凝胶纳米颗粒(DNA hydrogel nanoparticles,DNA gel NP)。首先,采用冷冻自由基聚合技术和分子包埋法制备了负载辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)的DNA凝胶,即HRP@DNA gel NP,作为Cas12a响应性可视化探针;然后,以诱导扩增反应的方式扩增HLB16S rDNA寡核苷酸片段,产生可结合cr RNA的H3。最后,利用H3激活的Cas12a反式裂解活性,催化HRP@DNA gel NP响应性崩坍。HRP@DNA gel NP凝胶骨架ss DNA的裂解,促使内部HRP释放催化溶液中的H2O2,TMB反应,实现HLB的可视化检测。对扩增酶含量、Cas12a酶含量优化后,最终实现了对HLB16S rDNA的特异性可视化检测,检测范围在10-2000 pmol/L,检测限为13.6 pmol/L。相比于第一个体系,DNA凝胶纳米传感器检测速度显著加快,仅需35分钟就可肉眼观察到黄龙病菌的存在,具有巨大的应用潜力。
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