论文部分内容阅读
目的:在雌性哺乳动物中,胚胎时期产生的卵母细胞决定了其一生生殖能力的上限。不同于精母细胞,卵母细胞早在胚胎期便进入减数分裂,依次经过第一次减数分裂前期的细线期、偶线期、粗线期,最后被阻滞在双线期的核网期。在这一过程中所发生的同源重组,不仅是物种遗传多样性的基础,其形成的染色体交叉还保证了青春期后卵母细胞成熟过程中同源染色体的正确分离。因此,第一次减数分裂前期的正常发展对于早期卵子发生必不可少。目前人类中发现的许多不孕症以及雌性动物繁殖率下降都与卵母细胞减数分裂异常密切相关。邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)是一种被广泛使用的增塑剂。DBP具有雌激素样活性,属于环境内分泌干扰物,其广泛的雌性生殖毒性引起大量关注。有研究证明,另一种邻苯二甲酸酯类化合物DEHP会损害第一次减数分裂前期进程,但DBP是否会对早期减数分裂进程产生影响还不清楚。因此,本研究旨在探讨DBP暴露对卵母细胞第一次减数分裂前期的影响及其作用机制,阐释DBP抑制第一次减数分裂前期可能产生的危害,为防控增塑剂污染和保障雌性生殖健康提供基础实验依据。方法:本研究分为体内实验和体外实验。(1)体内实验:将妊娠14.5日的CD1孕鼠随机分为对照组、1mg/kg-bw/d DBP组、10 mg/kg-bw/d DBP组、100 mg/kg-bw/d DBP组,连续灌胃3天后收集胎鼠卵巢,通过染色体铺展和免疫荧光染色对卵母细胞减数分裂时期进行分析。(2)体外实验:将分离得到的14.5日胎龄CD1胎鼠卵巢随机分为DMSO组、10μmol/L DBP组、100μmol/L DBP组,体外培养3天后收样。通过染色体铺展和免疫荧光对卵母细胞减数分裂时期以及同源重组完成情况进行分析;通过western-blot,qRT-PCR和免疫荧光检测同源重组关键因子的表达水平;检测DBP暴露后卵母细胞的ROS水平以及抗氧化酶SOD1、SOD2的蛋白表达水平;通过TUNEL法分析卵巢细胞的凋亡情况;利用染色体铺展和免疫荧光检测DBP作用于第一次减数分裂前期的受体途径。结果:1.小鼠胚胎期DBP暴露抑制卵母细胞第一次减数分裂前期进程。通过卵母细胞染色体铺展发现,DBP暴露会使第一次减数分裂前期粗线期卵母细胞比例显著减少,偶线期细胞比例增多。体内外实验结果一致。2.小鼠胚胎期DBP暴露扰乱同源重组。染色体铺展和免疫荧光检测结果显示,DBP暴露后同源重组的交叉位点蛋白MLH1数量增多,表明DBP暴露后同源染色体之间出现更为频繁的DNA交换。同时DNA双链交换蛋白RAD51和DNA损伤蛋白γH2AX表达水平也显著增加,提示DBP暴露后增加了卵母细胞DNA双链断裂位点的数量。3.DBP暴露可诱导胚胎期小鼠卵巢中的氧化应激反应。ROS检测发现DBP暴露后的胚胎卵母细胞中代表ROS水平的荧光强度明显增加,同时氧化应激标志物MDA和CAT的含量也明显升高。此外western-blot检测结果也显示,可反应细胞内氧化应激水平的超氧化物歧化酶SOD1和SOD2的蛋白表达水平升高。这可能是DBP增加卵母细胞DNA损伤的原因。4.DBP暴露导致同源重组中关键因子的表达下降。qRT-PCR及western-blot检测结果显示,DBP暴露使同源重组关键因子ATR、POLβ、SMC3、REC8表达水平下降。同时POLβ和REC8免疫荧光结果显示,在DBP组POLβ及REC8的荧光信号也明显减弱。这些结果表明DBP暴露后会使参与修复DSB的同源重组关键因子表达下降,从而破坏了DNA的损伤修复能力。5.DBP暴露诱导卵巢细胞凋亡。TUNEL检测结果显示,DBP暴露后卵巢中凋亡细胞数量增多,且DBP暴露后导致BAX/BCL2比例以及活化的Caspase3蛋白水平显著增加。这一结果表明,DBP暴露导致卵巢细胞凋亡,这极有可能是由于卵母细胞内积累的DNA损伤所导致的。6.DBP通过雌激素受体抑制第一次减数分裂前期进程。通过加入雌激素受体α特异性拮抗剂MPP、雌激素受体β特异性拮抗剂PTHPP,进一步检测DBP对第一次减数分裂前期作用的受体途径。染色体铺展和免疫荧光统计结果显示,DBP与MPP联合暴露、DBP与PTHPP联合暴露后,卵母细胞第一次减数分裂前期进程均得到逆转,表明DBP对第一次减数分裂前期的作用是通过雌激素受体α和β介导的。结论:小鼠胚胎期DBP暴露会诱导卵母细胞氧化应激水平升高,下调同源重组关键因子的表达,扰乱同源重组修复,积累DNA损伤,促进卵巢细胞凋亡,并通过雌激素核受体途径抑制卵母细胞第一次减数分裂前期进程,从而影响早期卵子发生。