论文部分内容阅读
水产品是人类摄取优质动物性蛋白的重要来源,而肌肉是水产动物主要的蛋白质储存库,也是决定水产品品质的关键。但随着养殖产量的增加,其肉品质逐渐呈下降趋势,除了养殖环境、病原微生物外,营养因素已成为影响水产动物肉品质的主要因素之一。然而,目前关于营养条件改变时水产动物肉品质的变化及其适应性调控机制尚不清楚。本文通过研究不同营养胁迫（高脂、饥饿）下中华鳖肌肉品质变化特点及其适应性调控机制,进一步阐明营养变化与肌肉品质及其内稳态平衡的关联机制,为水产动物肌肉营养与品质调控提供新的思路和依据。研究结果如下:通过营养胁迫（高脂饮食）实验,分析了正常饮食（ND）、高脂饮食（HFD）和高脂+N-乙酰半胱氨酸饮食（NAC）三组对中华鳖肌肉品质的影响。结果显示,与ND组相比,HFD组肌内脂肪含量显著增加,蛋白质含量减少,与多不饱和脂肪酸含量呈负相关（P＜0.05）。肌肉硬度、胶粘性和咀嚼性均显著下降（P＜0.05）,肌纤维间可见明显脂肪空泡沉积,间隙增宽且有少量纤维化。而在NAC组中,肌肉脂肪含量较HFD组明显减少,蛋白质含量增加,与肌肉不饱和脂肪酸含量呈正相关（P＜0.05）,肌肉硬度和胶粘性显著升高（P＜0.05）,肌肉组织形态得到明显改善。采用油红O染色、ELISA、q RT-PCR、Western blot、免疫组化和透射电镜等技术分析高脂饮食诱导中华鳖氧化应激与自噬对肉质的调控及其适应性机制。结果显示,与ND组相比,HFD组肌肉抗氧化信号分子Nrf2转录水平及其抗氧化酶系统均有不同程度降低,ROS及MDA、PC含量增加（P＜0.05）,肌肉氧化应激水平升高。同时,肌肉自噬相关基因ULK1、ATG5、Beclin-1、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、ATG13表达量显著增加,SQSTM1降低,自噬通路m TOR信号分子显著下调,AMPK上调（P＜0.05）;免疫荧光染色和Western blot检测发现自噬标志蛋白LC3表达增加,透射电镜观察到HFD组肌肉细胞自噬小体数量增多。NAC干预后,显著上调Nrf2及其下游抗氧化能力,并降低ROS和MDA、PC含量（P＜0.05）,有效地减轻氧化应激损伤。自噬相关基因ULK1、MAP1LC3A、MAP1LC3B的表达量较HFD组明显降低,SQSTM1升高,m TOR显著上调,AMPK下调（P＜0.05）;免疫荧光、Western blot和透射电镜观察到LC3表达及自噬小体数量明显减少,进一步证实了氧化应激与自噬对肉质的关联性。通过营养胁迫（饥饿）实验,分析了正常摄食（S0）和饥饿3天（S3）、7天（S7）、10天（S10）、15天（S15）以及饥饿15天后恢复摄食7天（R7）对中华鳖肌肉品质的影响。结果显示,随着饥饿时间延长肌肉蛋白质和脂肪含量呈降低趋势;氨基酸总量呈先降低后升高趋势,多不饱和脂肪酸与氨基酸总量变化一致,而饱和脂肪酸含量呈先升高后降低再升高趋势。当恢复摄食后,蛋白质和饱和脂肪酸含量恢复至正常摄食水平（P＞0.05）。饥饿7-15天后肌肉硬度、咀嚼性随饥饿时间增加而逐渐下降,内聚性呈升高趋势,弹性为先升高后降低;进一步研究可见肌纤维萎缩,肌细胞间隙增大。恢复摄食后,肌肉硬度和咀嚼性有所升高,肌纤维组织形态得到适应性修复,但未达到正常摄食水平（P＜0.05）。利用生物化学及分子生物学等技术分析饥饿状态下中华鳖氧化应激-自噬、营养代谢对肉质的调控及其适应性机制。结果显示,饥饿过程中肌肉Nrf2转录水平呈先升高后降低再升高再降低趋势,其下游抗氧化酶活性呈先上升后下降趋势,转录水平与Nrf2变化一致;而ROS恰好与Nrf2相反,MDA、PC含量逐渐升高。自噬相关基因ULK1、Beclin1、MAP1LC3A、MAP1LC3B表达为先升高后降低再升高,SQSTM1逐渐降低,m TOR为先降低后升高再降低,AMPK则相反;Western blot分析发现LC3蛋白表达呈先降低后升高趋势,透射电镜观察到饥饿过程中细胞自噬小体数量增加。当恢复摄食后,Nrf2及其下游抗氧化能力有所回升,并降低了ROS与MDA、PC含量（P＜0.05）,氧化应激有所缓解。另外,自噬相关基因ULK1、ATG5、Beclin1、MAP1LC3A、MAP1LC3B表达明显下降,SQSTM1升高,m TOR显著上调,AMPK下调（P＜0.05）;Western blot和透射电镜观察到自噬有所减少。随后,对饥饿状态下KLF15-BCAA信号轴在中华鳖肌肉能量代谢中的研究发现,饥饿期间KLF15转录水平呈先升高后降低趋势,蛋白水平逐渐升高;BCAA代谢相关酶BCAT、ALT活性与KLF15转录水平变化一致,BCAT转录水平与酶活变化一致,ALT持续升高;BCAA含量呈先降低后升高趋势,而Ala与之相反。当恢复摄食后,KLF15、BCAA代谢相关酶及Ala含量恢复到正常摄食水平,BCAA含量显著高于正常摄食水平（P＜0.05）。综上所述,本文揭示了营养胁迫（高脂、饥饿）下中华鳖肌肉品质的变化特点及其适应性调节机制,并阐明Nrf2/ARE-ROS-Autophagy和KLF15-BACC信号途径在肌肉中的调控作用,以新的角度阐述营养变化与肌肉品质及其内稳态平衡的关联机制,对水产动物肌肉营养与品质调控具有重要意义。