【摘 要】
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甘草是最常用的大宗中药材,其味甘,性平。归心、肺、脾、胃经,被誉为“药中之王”,是甘肃主要的地产药材之一,具有镇咳平喘、抗菌、抗氧化、抗癌及美白等多种药理作用。内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部,而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。基于此,本研究以甘肃地产甘草为材料,通过内生菌的分离,以期获得更具专属性的纤维素酶,将其应用于甘草活性产物提取中,并对分离内生真菌次级代谢
【基金项目】
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甘肃省食品药品监督管理局科研项目（项目编号:2018GSFDA016）；
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甘草是最常用的大宗中药材,其味甘,性平。归心、肺、脾、胃经,被誉为“药中之王”,是甘肃主要的地产药材之一,具有镇咳平喘、抗菌、抗氧化、抗癌及美白等多种药理作用。内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部,而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。基于此,本研究以甘肃地产甘草为材料,通过内生菌的分离,以期获得更具专属性的纤维素酶,将其应用于甘草活性产物提取中,并对分离内生真菌次级代谢产物进行生物活性研究,以期为甘草深层次的应用提供理论支持。本研究的内容具体如下:甘草中产纤维素酶内生菌株的筛选。以新鲜甘草为原料,通过甘草粉末、纤维素为基质设计筛选培养基,以刚果红染色法进行产纤维素酶菌株的筛选,以3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）进行菌株产纤维素酶活力的测定,以高效液相色谱法（HPLC）检测生物酶法提取甘草中甘草酸的含量,通过分子生物学方法进行产酶菌株的鉴别。结果筛选得到20株内生菌,其中刚果红染色确定13个株菌可以产纤维素酶,且酶活力超过30U的菌株共有6个。用于提取甘草中甘草酸的结果显示,菌株GG-3,G-0.5-1,G-1-1所产纤维素酶对提取促进作用明显,其中以菌株GG-3促进作用最好,进一步分子生物学鉴定方法显示菌株GG-3与Bacillus pumilus有99%的同源性。菌株GG-3的发酵以及产酶条件优化。以产酶菌株GG-3为材料,采用DNS法测定纤维素酶活力,吸光光度法测定菌体生长量,评价不同因素对其生长和产酶活力的影响。结果显示,羧甲基纤维素钠为碳源,牛肉膏为氮源,p H为7.5,碳氮比为1:2时,菌株GG-3生长最好;当碳源为蔗糖,氮源为酵母膏,p H为7～8,碳氮比为1:1.5时,菌株GG-3产酶最好;对所产纤维素酶酶学性质研究表明,该酶作用的最适温度是40℃,最适p H是8。金属离子对GG-3菌株所产纤维素酶的酶活力均有影响,其中Zn2+影响最为显著。生物法提取甘草中活性成分的工艺研究。以产纤维素酶菌株GG-3为出发菌株,发酵制备粗酶液并用以辅助提取甘草中的甘草酸。通过考察酶辅助提取中不同提取条件和不同酶解条件对提取甘草酸量的影响,最终确定酶解p H为8,加酶量24U/g,酶解温度37℃,单次提取时间为2h,提取时溶剂中氨性乙醇含量为30%,提取温度90℃时提取效果最好。进一步应用优化工艺提取的比较结果显示,菌株G-G-3所产酶对甘草酸的提取有明显的促进作用,经GG-3酶处理后提取较不加酶和添加市售纤维素酶分别提高了32.5%和31.3%,显示了较好的应用前景。甘草内生真菌的分离及鉴定。以新鲜采集的植物甘草为材料,设计了9种培养基,采用组织研磨法分离甘草内生真菌。结果从甘草植物中共分离得到了128株内生真菌。其中,甘草根部分得88株,茎部分得15株,叶部分得25株。进一步对分离菌株进行形态学和分子生物学的鉴定结果显示,分离所得内生真菌分别属于Cephalospporfum sp.、Absidia sp.、Trichderma sp.、Alternnrin sp.、Rhizoctonia sp.、Helminthoid sp.、Aspergillus sp.、Scopulariopsis Bainier.、Geotrichum sp.、Paecilomyces sp.、Aspergillus fumigatus.、Fusarium sp.、Uncultured fungus、Meyerozyma sp.、Nectria sp.、Pichia guilliermondii、Didymella macrostoma、Ceratobasidium sp.,该结果也提示甘草内生真菌具有丰富的多样性。内生真菌次级代谢产物活性研究。发酵分离所得甘草内生真菌,分别采用DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯）清除法、羟基自由基清除法及还原力法评价了其次级代谢产物的抗氧化活性,采用滤纸片法评价了其次级代谢产物的抗菌活性。结果显示GS-7菌株发酵液、G-J-5和G-J-1菌株菌丝体的供试样品对DPPH自由基的清除率分别达到了96.87%,97.60%、95.62%,与对照品清除率95.2%相当;GS-12、G-J-5、YS-4、GS-6和GS-10菌丝体供试样品对-OH自由基的清除率分别达到了96.70%、98%、98.32%、99.17%、97.74%,与对照品清除率95.3%相当,表现出了较强的体外抗氧化能力;YS-2、YB-3、YB-4发酵液与G-J-5和G-J-1菌丝体供试样品的总还原力与0.1mg/m L的Vc的还原力相当,显示出了较高的研究价值。抑菌实验结果表明,样品YS-6发酵液对大肠杆菌的抑菌活性达到链霉素的70%,其对地衣芽孢杆菌也具有良好的抑菌活性,达到青霉素的67%,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性达到青霉素的79%;样品G-J-5菌丝体对金黄色葡萄球菌有较高的抑菌活性,达到青霉素81%,展现出较强的抑菌活性。
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