【摘 要】
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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的基本病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）的沉积和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结,并伴有突触功能障碍和认知能力下降。尽管靶向Aβ的被动免疫治疗在临床试验中未能达到延缓认知损害的目的,这些单克隆抗体的实验数据为后续的研发提供了重要依据,Aβ寡聚体是脑内重要的毒性物质,应该作为单克隆抗体的首要清除目标。以
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81870819）Aβ3-10-KLH疫苗免疫防治Alzheimer病（AD）的机制探讨；
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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的基本病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）的沉积和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结,并伴有突触功能障碍和认知能力下降。尽管靶向Aβ的被动免疫治疗在临床试验中未能达到延缓认知损害的目的,这些单克隆抗体的实验数据为后续的研发提供了重要依据,Aβ寡聚体是脑内重要的毒性物质,应该作为单克隆抗体的首要清除目标。以焦谷氨酸修饰的N末端截短的Aβ肽（N-terminal truncated Aβpeptide modified with pyroglutamate,Aβp E3）代表了AD患者大脑中所有Aβ的重要组成部分,由于其更易于聚集和不易降解的特性,表现出了更强的毒性作用。基于前期的工作基础,Aβ3-10-KLH主动免疫转基因小鼠表现出了清除Aβ寡聚体改善认知的作用,我们以Aβ3-10为抗原筛选一种靶向Aβ的单克隆抗体,并进一步研究其作用机制。方法:1)以Aβ3-10-KLH为抗原,经过免疫、细胞融合和多轮筛选获得骨髓瘤细胞,摇瓶生产纯化得到单克隆抗体7B8,通过体外结合实验验证其结合Aβ类型。2)单克隆抗体7B8被动免疫治疗三转基因（3×Tg）AD模型小鼠,通过免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹和ELISA方法检测小鼠脑内Aβ的变化,通过免疫荧光染色方法探讨7B8清除Aβ的机制,通过行为学方法检测小鼠的认知功能变化,以及检测7B8被动免疫治疗对突触蛋白、tau蛋白磷酸化及脑内微出血的影响。结果:1)制备了单克隆抗体7B8,经鉴定重链恒定区为小鼠Ig G1,轻链恒定区为小鼠κ链;2)通过ELISA、Western、dot blot方法,显示制备的单克隆抗体7B8结合Aβ单体相对较弱,对Aβ42寡聚体、纤维体及Aβp E3单体、寡聚体、纤维体都有较强的结合作用;3)单克隆抗体7B8可以结合疏松和致密核心的老年斑,并可以结合细胞内的Aβ;4)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少皮层和海马内的硫磺素S阳性（P＜0.01）和6E10阳性老年斑（P＜0.05）;5)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少脑组织细胞内Aβ寡聚体和Aβp E3寡聚体;6)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少脑组织可溶性组分Aβ42总量（P＜0.05）及不可溶性组分（P＜0.05）Aβ40、Aβ42总量,减少脑组织可溶性组分（P＜0.05）及不可溶性组分（P＜0.01）Aβp E3总量;7)GFAP免疫组化染色显示3×Tg小鼠皮层（P＜0.05）和海马（P＜0.01）的星形胶质细胞的负荷均有明显减少,Iba1免疫组化染色显示3×Tg小鼠海马部位的小胶质细胞负荷减少（P＜0.05）;8)7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少了海马TNF-α和皮层IL-6的水平（P＜0.05）,未增加3×Tg小鼠脑内TNF-α、IL-6、IL-1β的总体水平;9)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠斑块附近的Iba1阳性小胶质细胞明显增多（P＜0.05）,单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少了海马部位的脑血管淀粉样变（cerebral amyloid angiopathy,CAA）（P＜0.05）;10)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠增加皮层和海马中的突触素水平（P＜0.01）,皮层中PSD95的水平有所增加（P＜0.05）,未增加脑内微出血（P=0.58）;11)7B8被动免疫治疗改善了3×Tg小鼠的絮窝评分（P＜0.05）,新物体识别实验中提高了小鼠的分辨指数（P＜0.05）;12)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠减少了海马AT180、p Tau396和p Tau404的水平（P＜0.05）,但是HT7和AT8水平未见明显变化。结论:1)制备的新型单克隆抗体7B8可以结合Aβ42和Aβp E3寡聚体、纤维体,对Aβ42单体结合能力相对较弱;单克隆抗体7B8可以结合疏松和致密核心的老年斑,并可以结合细胞内的Aβ组分。2)单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠,减少了脑组织中Aβ寡聚体和老年斑,同时清除了脑可溶性和不可溶性组分中Aβp E3总量,减少了CAA病理;单克隆抗体7B8被动免疫治疗3×Tg小鼠清除脑内Aβ同时,减轻了脑内炎症反应,减少了tau蛋白磷酸化水平,保护突触功能,未增加脑内微出血,改善了小鼠认知功能;单克隆抗体7B8被动免疫治疗清除Aβ的机制符合FcγR介导小胶质细胞募集吞噬作用和外周沉积假说,同时未增加脑内炎症因子的水平。
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