论文部分内容阅读
目的:观察转染PTEN干扰RNA(PTEN siRNA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探讨PTEN对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及可能机制。方法:1.体外培养NR8383,将细胞分成两组:对照组转染Control siRNA,干扰组转染PTEN si RNA,分别选取10nM、20nM、40nM浓度转染24小时,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后两组细胞中PTEN mRNA表达,采用蛋白质印迹法(western blot)检测转染后两组细胞内PTEN蛋白表达。优化转染条件,选择20nM为最佳实验转染浓度。2.将NR8383细胞分成两组:对照组转染Control siRNA,干扰组转染PTEN si RNA,转染24小时后,两组细胞分别用终浓度1μg/ml LPS刺激细胞6小时,采用RT-qPCR检测两组细胞内TNF-αmRNA表达,采用western blot检测两组细胞内AKT磷酸化水平,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化。结果:1.与对照组比较,10nM、20nM和40nM干扰组PTEN mRNA表达分别下调至(0.33±0.01)倍(P<0.01)、(0.23±0.01)倍(P<0.01)、(0.21±0.01)倍(P<0.01);PTEN蛋白表达分别下降至(0.30±0.03)倍(P<0.01)、(0.14±0.02)倍(P<0.01)、(0.10±0.02)倍(P<0.01);在干扰组中,与10nM浓度比较,20nM、40nM浓度PTEN蛋白表达有统计学差异(P<0.01)。20nM与40nM浓度比较,PTEN蛋白表达差异无统计学意义(P=0.08)。2.两组细胞LPS刺激6小时后,与对照组比较,p-AKT/AKT蛋白比值从(0.26±0.02)表达上升至(0.52±0.03)倍(P<0.01),干扰组细胞中TNF-αmRNA表达上调至(1.56±0.18)倍(P<0.01)。Control si RNA+LPS对照组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1632.56±52.05pg/ml,PTEN siRNA+LPS干扰组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1834.07±57.00pg/ml(P<0.05)。结论:转染PTEN si RNA入NR8383细胞后,可上调AKT磷酸化水平,促进LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-α的表达。因此,我们推测PTEN可能通过PI3K-AKT通路参与调控LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。