随着中药产业的不断发展,广泛用于药物产品和中药制剂的药用植物需求量不断增长,而中药材的真实性则制约了其商业贸易和临床用药安全。中药鉴定技术经历了从传统四大鉴定方法到以DNA条形码及其相关快速检测技术为代表的分子鉴定,为传统鉴定技术提供了有效客观的补充。研究显示,具有高水平物种鉴定效率的ITS2序列,在药用植物的鉴定上可以作为通用的条形码序列。为了更快得到鉴定结果,在已知物种序列的基础上,广大研究学者们开发了一些快速鉴定的方法和技术。因生物传感技术拥有许多优点,如微型化的装置易于携带、低成本、高的灵敏度和特异性、分析速度快等,已被广泛用于医学研究及临床检验诊断和床旁检测。该技术能够从DNA分子层面对中药材进行快速鉴别,特别是对于一次性便携芯片式传感器,事先对其进行批量修饰、分子功能化之后,可进行室外的田间检测。因此,在中药鉴定领域,这类便携式电化学生物传感器将具有广阔的应用前景。本文以珍贵中药材西红花为例,旨在开发出一种纳米电化学草药传感器用于快速鉴别中药材。首先使用DNA条形码技术鉴定收集到的中药样品的真伪,根据样品的ITS2序列信息设计出只与正品特异性互补的DNA探针,该探针作为后续电化学传感器的特异性识别元件;随后制备了一种高曲率三维纳米结构阵列的电化学草药传感界面,该传感器使用丝网印刷碳电极(SPCE)作为基底,在碳工作电极上一步沉积分枝状金纳米花结构,与二维平面金电极相比,该传感器可有效提高DNA杂交效率,实现对珍贵中药材西红花及其混伪品的快速鉴别。具体研究内容主要分为以下三个部分:第一部分:西红花及其易混品的DNA条形码鉴定采用试剂盒法提取在市场上收集的西红花及其常见易混品药材的总DNA,使用通用引物进行PCR扩增,测序后,运用分析软件对序列峰图进行校对拼接后,去掉序列两端的5.8S和28S区段以得到ITS2序列;然后在中药材DNA条形码鉴定系统和NCBI数据库对样品的ITS2序列进行比对以确定收集的物种准确性。实验结果表明,大部分样品的ITS2序列可以比对到种,少部分比对到属,不同物种之间可以很好的区分开,西红花和混伪品的ITS2序列差异性明显。随后,通过比较分析西红花及其混伪品ITS2序列的差异,设计出对西红花特异的探针序列,以作为后续传感器的固定探针。第二部分:高曲率纳米结构界面的构建及其杂交动力学研究该实验使用市售的丝网印刷碳电极作为基底,通过无光刻的电化学沉积技术在基底上修饰了纳米粗糙度的金花结构阵列,使用扫描电子显微镜来表征其表面形貌的逐步修饰过程。基于ITS2序列信息,设计了三种不同的DNA靶标,用于探讨不同互补模式的杂交动力学。实验结果表明,无论是哪种杂交模式,这种跨尺度(包括宏观尺度碳表面和纳米级金分支)的三维纳米结构界面与二维平面金电极界面相比,缩短了杂交所需的时间约30 min,提高了DNA杂交效率,也表现出较高的电化学响应信号。在0.5 M稀硫酸中采用循环伏安法(CV)对两种界面的有效活性金面积进行了考察,结果表明,三维纳米结构界面的有效活性金面积是平面金电极的5.4倍。该实验证明了构建的高曲率纳米结构界面在检测较长链的DNA分子上有明显的优势,为该界面通过DNA分子用于鉴定中药材提供了理论依据。第三部分:基于HCAuNS的便携式电化学草药传感器用于西红花的快速鉴定为了更好地将构建的高曲率金纳米结构(HCAuNS)界面用于中药材西红花的快速鉴定,我们对固定探针的浓度进行了优化,从杂交动力学实验中也确定了杂交时间,随后还探讨了传感界面的灵敏度、特异性和重复性。实验结果表明,构建的电化学草药传感器具有很高的灵敏度,对于中间杂交模式中64个碱基的靶标,其检测限可低至0.18 fM,即使对单碱基错配也显示出良好的特异性。该传感器还可以通过直接检测带有ITS2序列的未纯化的不对称PCR扩增子(~500 bp),将西红花与其他六种混伪品精确区分开,这表明它在基于DNA分子鉴定基础上的草药田间鉴定和病原菌领域具有巨大的应用潜力。