研究背景药物本身或/及其代谢产物导致的肝脏损伤称为药物性肝损伤,亦称为药物性肝病,临床上可表现为各种急慢性肝病,轻者停药后可自行恢复,重者可危及生命。因其可能导致的严重临床后果,药物性肝损害是导致众多药物撤回的重要原因,在过去的60年里,大约25%的药物撤回是由于其具有肝毒性,这极大的增加了药物研发的成本及风险。因此在新药研发过程中,测试药物及其代谢产对肝脏是否产生损害是重要的一环。传统方法在动物体内实验进行药物毒性研究,不仅耗费大量人力财力、存在伦理问题、实验周期长,且由于种属差异、个体差异导致实验结果并不能很好的反应药物的真实毒性。而体外细胞模型因具备实验周期短,重复性好,易于操作、高通量等优点而被用于药物肝毒性筛选。尽管体外肝细胞培养模型越来越多的被应用于药物的吸收、代谢、分布、排出(ADME)及毒性的检测,然而传统的体外细胞二维培养模型仍然不足以完全替代动物模型用于预测药物在人体的毒性作用。其原因在于细胞在体外培养时缺乏足够的功能与结构,由此在ADME及毒性的检测上难以提供足够准确的预测结果。三维培养由于增加了细胞与细胞之间的联系,能够促进细胞体外培养时功能与表型的表达与维持;由此能够提供更准确的体外预测结果。细胞成球培养是常用的三维培养模型,成球培养的细胞球具有从细胞球表面至中心形成一定的氧气、营养物质浓度梯度的特性,契合了肝小叶从汇管区至中央静脉的氧气、营养物质浓度梯度分布特点;既往结果表明成球培养的肝细胞具备更好的功能。然而细胞球由于中心细胞供氧较低,容易出现中心细胞坏死。持续灌流培养能够模拟细胞在体内所处的体液流动产生的剪切力作用,能够促进细胞的功能表达与维持,同时持续灌流培养加快了营养物质的更换与代谢废物的产生,减缓细胞球中心缺氧情况,具备弥补细胞成球培养缺陷的可能。但是结合成球培养与持续灌流培养作为药物筛选培养的报道较少。为此本课题通过结合两种培养方式,建立一种新的药物筛选模型,并验证其作为药物筛选模型可行性。目的建立一种结合成球培养与持续灌流培养的药物筛选模型并评估方法设计与孔板适配的印章式成球工具,以琼脂糖为基质制作模具,将hepG2细胞接种于制作的琼脂糖模具中,静置24小时后待细胞成球。将细胞球连同模具一起转移入tissueflex反应器中,流速设定为1ml/24h。设置对照组为静态培养的细胞球,每24h更换培养液1ml。分别在2、4、6、8四天观察细胞球的形态、进行死活染色、CCK-8绘制细胞球生长曲线。并提取RNA进行RT-qPCR检测细胞CYP酶表达情况。依据前面结果选定在培养第五天进行药物干预实验,测定2个肝毒性阴性药物,6个肝毒性阳性药物分别测定他们的IC50。采用SPSS软件进行统计学分析。结果1.形态学观察表明:利用tissueflex进行持续灌流培养的细胞球细胞更紧致,细胞球生长更快,但两者在第6天均达到了平台期,不再增大。通过CCK-8测定细胞球生长曲线表明动态细胞的活率较静态更高,同时两者均在第6天达到最高,第六天由于细胞球直径过大细胞开始凋亡。2.死活染色显示动态细胞球内部细胞死亡细胞更少,细胞存活率更高;3.药物肝毒性实验显示动态培养条件下药物的IC50更低,动态培养较静态培养的敏感性更高。结论1.持续灌流培养肝细胞球能够更好的表达与维持肝细胞药物代谢功能;2.持续灌流培养肝细胞球能够更准确的预测药物的肝毒性,是一个良好的药物筛选模型。