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血栓性疾病是一类严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病,常见的有急性心肌梗死、脑血栓、肺静脉栓塞、动脉血栓和缺血性休克等,其中急性心肌梗死的病死率高达30％。近年来,溶栓药物的研发主要集中在两方面,一方面为筛选新来源的溶栓药物,另一方面为通过基因工程和单克隆抗体技术改造已有溶栓药物,其目的是降低纤溶酶的抗原性,提高其安全性及活力。多数有效的溶栓剂是从生物体内发现的,生物体是溶栓药物的主要来源,由于微生物来源的纤溶酶具有很多优点,所以其是纤溶酶的重要来源之一,已有多种纤溶酶产生菌被分离出来,因而得到各国研究者的重视。
本文利用纤维蛋白平板法从豆豉中筛选到一株纤溶酶高产菌株,命名为S-7,进行菌株鉴定并优化其最佳液体发酵条件,分离纯化S-7菌株产生的纤溶酶,研究其酶学性质及体外溶栓特性,并对其动物安全性进行了研究。主要试验结果如下:
根据菌落、菌体形态观察、生理生化反应及16SrDNA序列分析表明,纤溶酶产生菌S-7与芽孢杆菌属(Bacillusspp.)的Bacillusaerius形态相似、生理生化特征基本相符,再结合16SrDNA序列系统发育树同源性分析,两者同源性达到99.60%,因此,初步确定纤溶酶产生菌S-7为Bacillusaerius。
采用单因子试验和正交试验对BacillusaeriusS-7进行产纤溶酶摇瓶发酵工艺优化,结果表明最佳培养基组成为:玉米粉5g,葡萄糖5g,豆饼粉20g,K2HPO4·12H2O2g,KH2PO4·2H2O1g,MgSO4·7H2O1.5g,CaCl2·2H2O0.5g,NaCl1g,蒸馏水1000mL,培养基初始pH值7.5,最佳发酵条件为:250mL三角瓶装液量30mL,接种量2%,培养温度37℃、旋转摇床转数200r/min,发酵时间48h,在此条件下该菌产纤溶酶酶活力(相当于尿激酶)达到942.09±4.18U/mL,,比未优化前提高4.7倍。
通过硫酸铵沉淀、透析以及DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法提取纯化BacillusaeriusS-7产生的纤溶酶,结果获得单一纤溶酶组分(S-7FE-1),表观相对分子质量为55kDa,测得S-7FE-1N-末端10个氨基酸为ANLNGTLGGM,N-末端氨基酸序列分析表明S-7FE-1与己报道的其它生物来源的纤溶酶没有同源性,属于新型纤溶酶。S-7FE-1的最适作用温度为30℃,最适反应pH为8.0,在pH4到9以及4℃到50℃之间活性稳定,Fe3+使S-7FE-1完全失活,而其他离子对其作用不明显,EDTA对S-7FE-1的活性抑制作用较大,PMSF能完全抑制其活性,表明该酶可能是含金属离子的丝氨酸蛋白酶。
体外溶栓和安全性试验结果表明,S-7FE-1具有良好的溶栓及抗凝作用,无溶血现象,不引起机体出血,无机体过敏反应,初步结论为S-7FE-1较为安全。